《Veterinary Microbiology》：Identification and vaccine efficacy evaluation of a canine coronavirus isolated in central China
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犬冠状病毒IIa亚型WH2023株的致病性及疫苗研发。该病毒分离自武汉犬场，病理学研究显示高致病性，肠黏膜病变显著。基于WH2023株开发GEL02佐剂灭活疫苗，免疫犬只中和抗体达1:5404，保护率100%，抗体水平持久超300天。
张晓宇|李颖|刘欣|周明|赵玲
华中农业大学农业微生物国家重点实验室，中国武汉430070
摘要
犬冠状病毒（CCoV）是犬类中一种重要的肠道病原体，尤其是在群养环境中。尽管它通常与轻度肠炎相关，但其高突变率导致了基因多样化，影响了病毒的毒力，并降低了传统疫苗的有效性。为应对这一挑战，我们从中国武汉的一个繁殖场分离出了一种新的CCoV株WH2023。对刺突（S）基因的系统发育分析表明，WH2023是主要的CCoV-IIa亚型。在小狗中的致病性研究表明，该病毒具有高毒力：在高剂量（10^6 TCID50/mL）感染后，100%的小狗出现症状，表现为严重腹泻和嗜睡，空肠和回肠出现肠道病变，以及与典型CCoV致病性一致的高病毒载量。基于WH2023并使用GEL02佐剂制备的灭活疫苗在比格犬幼崽中进行了评估。安全性评估显示其具有良好的安全性；免疫原性研究显示，在加强接种一周后，中和抗体滴度达到了1:5404（12.4 log2）。接种疫苗的犬只完全抵御了WH2023的感染，而未接种疫苗的对照组则发生了胃肠炎。接种疫苗的犬只的中和抗体滴度在300天内始终保持在1:32以上，显著高于中国市场上现有商业疫苗所诱导的抗体滴度。这些发现表明，WH2023是一种高毒力的CCoV-IIa亚型，是开发疫苗的有希望的候选株，能够提供更好的安全性和持久的保护作用。
引言
CCoV是犬类中重要的肠道病原体，尤其影响新生犬和幼犬，导致腹泻、呕吐和脱水。与其他病毒病原体（如犬细小病毒2型、犬腺病毒1型和犬瘟热病毒）的共感染会加剧病情的严重程度，据报道在高达87%的病例中存在共感染（Decaro和Buonavoglia，2008年；Mira等人，2024年）。鉴于伴侣动物在“同一健康”（One Health）概念中的重要作用——它们的健康直接关系到人类和环境的健康——控制这些传染性病原体至关重要（Zhao等人，2024年）。
CCoV分为两大基因型：CCoV-I和CCoV-II，其中CCoV-II在亚洲和欧洲更为普遍，并进一步分为IIa和IIb亚型（Decaro等人，2011年；Morowitz等人，2011年）。虽然已有基于CCoV-IIa的疫苗，但现场研究表明，这些疫苗对当前流行的病毒变体的保护效果可能不够理想（Decaro等人，2007年；Licitra等人，2014年）。
刺突蛋白是一种关键的结构糖蛋白，负责介导病毒进入细胞和免疫识别。它由两个亚基S1和S2组成。S1亚基含有受体结合域（Tortorici等人，2022年），该域决定了宿主细胞的附着和组织趋向性，是中和抗体的主要靶标，因此对疫苗诱导的免疫力至关重要。S2亚基介导膜融合，并包含更多保守区域，这些区域有助于产生交叉反应性免疫应答，尽管其免疫原性通常低于S1亚基（Ko等人，2022年）。任一亚基中的氨基酸替换都可能影响病毒的感染性和抗原性。
关于中国本地流行的CCoV-IIa变体的遗传和免疫原性特征，目前的数据非常有限。为此，我们从武汉的一个繁殖犬舍暴发中分离出了WH2023这一当代CCoV-IIa株。对S蛋白进行了测序并分析了其遗传演化和氨基酸变异情况。基于这些发现，我们使用MONTANIDE? GEL02 PR佐剂制备了灭活疫苗，并在比格犬幼崽中评估了其安全性、免疫原性和保护效果。
样本收集、细胞和动物
2024年，中国湖北省武汉市的一个犬类繁殖场发生了疾病暴发。主要临床症状包括嗜睡、厌食、呕吐和腹泻，常伴有脱水。从有症状的犬只身上采集了拭子样本，并立即在冰上保存。CRFK细胞在添加了10%胎牛血清（FBS；Gibco，广州）的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM；Gibco，上海）中培养。
WH2023病毒的分离与鉴定
本研究的目的是分离WH2023株。为此，将处理后的拭子样本的上清液连续盲传三次至CRFK细胞中。随后通过间接免疫荧光试验（IFA）检测接种了WH2023株的CRFK细胞，观察到特异性绿色荧光（表明CCoV感染）以及细胞融合现象（图1 A），这与观察到的细胞病变（CPE）一致。
讨论
CCoV在犬类群体中仍然非常普遍，尤其是在犬舍和繁殖场中，快速的病毒进化产生了基因多样化的变体，这些变体可能影响病毒的毒力和疫苗的保护效果（Dong等人，2022年；Stavisky等人，2012年）。在中国，不断多样化的CCoV-IIa株使得基于历史株或国外株开发的疫苗的有效性存在不确定性（Shi等人，2024年）。为了更好地反映当前流行的病毒，我们分离出了...
结论
总之，我们开发了一种具有良好安全性和强免疫原性的灭活疫苗候选株。该疫苗源自具有流行病学意义的WH2023株，并使用了GEL02佐剂进行制备。WH2023-GEL02疫苗诱导了持久的中和抗体反应，免疫后至少300天内抗体滴度保持在1:32以上。与市场上现有的商业疫苗相比，WH2023-GEL02疫苗诱导的中和抗体水平相对更高。
作者贡献声明
周明：撰写——审稿与编辑、验证、监督、资源管理、项目协调、资金获取、数据分析。赵玲：撰写——审稿与编辑、数据可视化、验证、监督、资源管理、方法学设计、资金获取、数据分析、概念构思。刘欣：撰写——初稿撰写、数据验证、软件使用、实验设计、数据管理。张晓宇：撰写——审稿与编辑、初稿撰写、数据可视化。
伦理声明
本研究中进行的动物实验严格遵循了中国科技部制定的《实验动物护理和使用指南》。所有涉及动物的程序均在华中农业大学实验动物中心完成。实验方案经过了华中农业大学科学伦理委员会的审查和批准（批准编号：HZAUDO-2025–0017）。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的研究工作。
致谢
本研究得到了国家自然科学基金（项目编号：U24A20449）和中央高校基本科研业务费（项目编号：2662025DKPY009）的支持。本手稿中的一些图表元素是用BioRender.com软件制作的。
