《The Veterinary Journal》：The effect of dry-period heat stress on inflammatory, oxidative and metabolic alterations, and acquired immunity in dairy cows and offspring
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干奶期热应激通过影响氧化代谢参数和免疫细胞亚群改变调控牛与犊的免疫应答，提供降温措施可改善Th1/Treg/γδT细胞功能及炎症因子平衡，但母体热应激对犊免疫细胞无显著影响。
梅赫梅特·阿克科塞（Mehmet Akk?se）|哈利特·坎贾（Halit Kanca）|图尔古尔·霍什布尔（Tu?rul Ho?bul）|塞玛·奥伦（Sema ?ren）|穆拉特·奥努尔·亚兹利克（Murat Onur Yazl?k）|乌富克·卡亚（Ufuk Kaya）|梅尔特·佩克詹（Mert Pekcan）|哈蒂杰·埃斯拉·乔拉科卢（Hatice Esra ?olako?lu）|尤努斯·富尔坎·阿尔特因巴什（Yunus Furkan Alt?nba?）|哈桑·卡拉库什（Hasan Karaku?）|梅赫梅特·里法特·武拉尔（Mehmet R?fat Vural）
九月九日大学（Dokuz Eylül University），兽医学院，产科与妇科系，布卡（Buca），伊兹密尔（?zmir）35400，土耳其
摘要
本研究旨在探讨干奶期热应激对奶牛及其后代的新陈代谢和氧化应激参数、细胞因子释放以及T淋巴细胞比例的影响。32头荷斯坦奶牛被随机分配到热应激组（HS）和降温组（CL）。在预期分娩日期前21至28天以及分娩后立即从奶牛身上采集血液样本，以分离外周血白细胞；同时也在犊牛出生后（摄入初乳前及出生后24±1小时内）采集样本。通过流式细胞术计数辅助性T细胞（Th1、Th2）、调节性T细胞（Treg）和γδT细胞。使用牛特异性商业酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒检测干扰素γ（IFN-γ）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素-17A（IL-17A）、IL-10、IL-6、IL-1β、视黄醇、α-生育酚、乳铁蛋白和免疫球蛋白G（IgG）的水平。通过自动分析仪测量一氧化氮、对氧磷酶、总抗氧化能力、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、过氧化氢酶、丙二醛（MDA）、白蛋白、总蛋白、胆固醇、胆红素和肌酐的水平。与降温组相比，热应激组的血清视黄酸和α-生育酚水平显著降低（p < 0.05），ALP、过氧化氢酶、GSH-Px和IL-1β水平显著升高（p < 0.01）；热应激组的Th1淋巴细胞比例显著增加（p < 0.01），而γδT细胞和Treg淋巴细胞比例显著降低（p < 0.01）。Treg淋巴细胞比例在两组间无差异，但存在日变化。具体而言，在热应激组和降温组的母牛中，分娩时的Treg淋巴细胞比例均显著低于预期分娩日期前21天的水平（p = 0.021）。热应激组的初乳IgG浓度也较低（p < 0.05）。在后代中，分娩前及出生后24±1小时的T淋巴细胞比例和血清IgG浓度在两组间无显著差异。研究结果表明，为干奶期奶牛提供热应激缓解措施可能调节Th1、Treg和γδT淋巴细胞的功能以及促炎和抗炎细胞因子的释放。然而，子宫内的热应激并未影响犊牛摄入初乳前的淋巴细胞比例。
引言
热应激是奶牛生产可持续性的主要威胁。与1951-1980年的参考期相比，全球平均环境温度上升了1.8°C，并预计到本世纪末将进一步上升5.8°C（联合国粮农组织，2024年）。生物体仅在一定的温度范围内才能有效执行其正常的生理功能。对于奶牛而言，这一温度范围是环境温度介于-13°C至+24°C之间，体温介于38.5°C至39.1°C之间（Godyń等人，2019年）。当环境温度超过25°C且温度-湿度指数（THI）超过68时，奶牛会出现干物质摄入量减少、肠道通透性增加和泄漏现象，并伴随激素、代谢和免疫变化，这些都会降低产奶量和繁殖能力（Gupta等人，2022年）。
奶牛对热应激的敏感性与其产奶量、妊娠期和年龄密切相关。奶牛及其后代生命周期中最关键的时期是妊娠的最后两个月。胎儿经历的热应激不仅会降低其出生后前6个月的存活能力，还会因表观遗传变化而产生长期影响，如首次分娩年龄延迟、产奶量降低和繁殖能力下降（Cartwright等人，2023年）。此外，在妊娠最后两个月暴露于不良环境条件下会降低该时期接种的预防性疫苗的效果，这也体现在后代身上（Vojtek等人，2018年）。在高产奶牛中，先天免疫系统与代谢功能调节机制之间的相互作用在适应妊娠最后两个月的不良环境条件中起着重要作用（Diddeniya等人，2024年）。然而，这对后代出生后24小时内的获得性免疫的影响尚未完全阐明。
胎儿的体温调节或胎儿-母体热交换取决于胎儿-胎盘循环、胎儿膜、羊水及子宫壁。大约85%的热交换通过胎儿-胎盘循环完成，母牛直肠温度每升高1°C，子宫组织的血流量会减少20-30%（Dado-Senn等人，2020年）。我们最近发现，在干奶期经历热应激的母牛所生的犊牛出生时存在炎症反应（Akk?se和Vural，2026年）。然而，干奶期内经历子宫内热应激的犊牛出生时的细胞因子水平与其母牛分娩时的细胞因子水平之间没有相关性。这表明，干奶期内经历热应激的母牛的炎症反应并未影响胎儿的血液循环。相反，子宫内热应激导致的犊牛体内促炎细胞因子水平升高是由于胎儿体温调节（或散热）系统失效所致。因此，只有当母牛在干奶期免于热应激（例如通过降温措施或选择耐热奶牛）时，其胎儿才能有效散热。干奶期内出生的耐热奶牛所生的犊牛具有更好的体温调节能力和免疫力（Chen等人，2025年）。
Skibiel等人（2018年）报告称，母体热应激还会引起表观遗传变化，如犊牛DNA甲基化差异。具体来说，在妊娠最后45天经历热应激的母牛所生的犊牛中，约400个基因的DNA甲基化发生改变，100个基因的表达也发生变化。这些基因控制着与转录和翻译、先天免疫、细胞信号通路、酶激活、细胞增殖和凋亡相关的蛋白质。因此，它们是生命前两年表观遗传变化的重要指标。Skibiel等人（2018年）还发现，出生后立即采集的犊牛肝脏样本显示与免疫相关的通路存在转录后和翻译后修饰。例如，AGER基因的激活会导致免疫细胞增殖、凋亡、自噬和细胞迁移增加；RAGE基因的配体结合会增加细胞内的活性氧，同时抑制谷胱甘肽和抗坏血酸等抗氧化机制。
先天免疫系统包括粒细胞、巨噬细胞和补体蛋白，而适应性免疫系统包括T淋巴细胞和B淋巴细胞。某些细胞同时具有先天和适应性免疫特性，如γδT细胞和自然杀伤（NK）细胞（Tizard，2017年）。牛的免疫系统包含独特的调节性细胞群，尤其是γδT细胞，它们在先天和适应性免疫中起着关键作用。γδT细胞是专门的调节性淋巴细胞，与传统的调节性T细胞（Treg）不同（Guerra-Maupome等人，2019年；Hoek等人，2009年）。在犊牛出生后的前六个月，γδT细胞占T淋巴细胞总数的60%，而在成年牛中这一比例降至约10-20%（Guerra-Maupome等人，2019年）。
本研究的目的是检测妊娠最后两个月经历热应激的奶牛的新陈代谢、促炎和氧化应激参数的变化，以及Th1、Th2、Treg和γδT淋巴细胞比例的变化。此外，还探讨了这些变化对犊牛出生时（摄入初乳前）的Treg、Th1、Th2和γδT淋巴细胞比例及被动免疫状态的影响。
动物和研究设计
本研究于2022年6月至9月在土耳其穆拉拉省（Mu?la）达拉曼（Dalaman）地区的一个奶牛场进行。研究对象为32头荷斯坦奶牛，体况评分在3.0至3.5之间，正处于干奶期的第45-60天。研究分为两组：热应激组（HS，n=16头）在妊娠最后两个月（6月至9月）处于热应激环境中；降温组（CL，n=16头）则未受到热应激影响。
干奶期热应激对奶牛生理反应和妊娠期长度以及后代出生体重的影响
研究期间，6月的THI值为70-80，7月和8月为80-90，9月15日后低于70。降温组中有1头奶牛和热应激组中有2头奶牛产下了双胞胎犊牛。热应激组的平均直肠温度（39.6±0.3°C vs 38.8±0.3°C）和呼吸频率（69.6±13.03次/分钟 vs 48.4±10.0次/分钟）显著高于降温组。热应激组的妊娠期比降温组短约6天。
讨论
本研究表明，与处于降温环境中的奶牛相比，干奶期热应激对奶牛及其后代的获得性免疫、炎症反应以及代谢和氧化应激参数有显著影响。
本研究于2022年6月至9月在土耳其进行，期间THI始终高于68。对于奶牛而言，环境温度超过24°C且THI超过68被视为热应激。
局限性
本研究存在几个局限性。首先是在干奶期开始时未进行采样，因此我们无法确定最初是否存在T淋巴细胞亚群的差异。尽管如此，在预期分娩日期前21天，降温组中观察到的γδT淋巴细胞比例较高，这可能反映了降温措施的积极作用。其次，研究设计未考虑其他可能影响结果的因素。
结论
本研究表明，与处于降温环境中的奶牛相比，干奶期热应激的妊娠奶牛的氧化、炎症和代谢参数发生了变化。在预期分娩日期前21天，降温组的γδT淋巴细胞比例显著较高；而从预期分娩日期前21天到分娩期间，两组动物的γδT淋巴细胞比例均显著下降。
作者贡献声明
塞玛·奥伦（Sema ?ren）：资源准备、方法论设计、实验实施。穆拉特·奥努尔·亚兹利克（Murat Onur Yazl?k）：实验实施、概念构思。哈利特·坎贾（Halit Kanca）：方法论设计、实验实施、概念构思。图尔古尔·霍什布尔（Tu?rul Ho?bul）：数据可视化、资源准备、方法论设计、实验实施、数据分析。乌富克·卡亚（Ufuk Kaya）：实验实施、数据分析。梅尔特·佩克詹（Mert Pekcan）：方法论设计、实验实施、概念构思。哈蒂杰·埃斯拉·乔拉科卢（Hatice Esra ?olako?lu）：方法论设计、实验实施。梅赫梅特·里法特·武拉尔（Mehmet R?fat Vural）：论文撰写、审稿与编辑、初稿撰写、研究监督。
伦理声明
所有动物实验和程序均经过安卡拉大学动物护理与使用伦理委员会（协议编号：2021–10–68）的批准，并按照其指南和规定进行。
写作过程中未使用生成式人工智能和人工智能辅助技术
作者声明在写作过程中未使用任何生成式人工智能（AI）或人工智能辅助技术。本研究的全部步骤均通过人类的智力劳动完成，并遵循学术伦理标准。
资金来源
本研究得到了安卡拉大学科学研究项目协调单位（项目编号：21B0239001）的支持。
致谢
作者感谢达拉曼农业企业的技术人员在本研究中的协助，同时也感谢土耳其农业和林业部农业企业总局允许他们在该企业进行实验。
