《Veterinary Parasitology》：Fasciola gigantica: Ultrastructure and cytochemistry of tegumental secretory activity and extracellular vesicle formation in juvenile flukes migrating in mouse liver
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Fasciola gigantica的幼虫在肝组织迁移过程中，表面分泌体T1、T2、T3通过胞吐作用维持糖萼结构并适应宿主环境，T1分泌体参与免疫复合物脱落，T2维持细胞膜功能，T3可能与幼虫生长相关。研究通过透射电镜和PATCO/Ruthenium Red染色揭示其 tegument动态结构及功能分化。
R.E.B. Hanna|G.P. Brennan|M.W. Robinson|P.-E. Kajugu|J.M. Quinn|C.E. Bennett
英国贝尔法斯特Stormont的农业食品与生物科学研究所（AFBI）兽医科学部门，邮编BT4 3SD
摘要
是热带地区肝片吸虫病的主要致病菌，对全球农业社区造成了重大经济损失，同时也被认为是一种重要的人类病原体。这种吸虫的表皮位于宿主与寄生虫的交界处，是一个代谢活跃且高度动态的分泌器官，其主要功能是确保寄生虫在恶劣的免疫和物理化学环境中存活。幼虫在宿主肝实质中的迁移过程对于建立一种可持续的宿主-寄生虫关系至关重要，但由于技术难度，这一过程尚未得到充分研究。本文通过传统的透射电子显微镜（TEM）以及周期酸-硫代碳氢肼-锇（PATCO）和钌红（Ruthenium Red）方法对实验感染小鼠感染4周和7周后从肝实质中收集的幼虫的表皮进行了观察。表皮中的T1分泌体通过胞吐作用维持表面的糖萼结构，以应对宿主免疫系统的攻击。这些分泌体的边界质膜形成了微绒毛层，这些微绒毛可能参与宿主-寄生虫之间的信号传递和免疫调节。表皮中的T2分泌体含有稳定的糖蛋白，其主要作用可能是为寄生虫进入胆管时适应物理化学环境的变化做准备。在表皮的亚合胞区还发现了一种新的细胞类型，称为T3细胞，其分泌体可能参与幼虫表皮蛋白组的形成。迁移中的幼虫的这些表面分泌活动可能产生一系列具有治疗潜力的分子产物。
引言
肝片吸虫病被公认为反刍动物生产领域的重要经济损失原因，并且是一个重大的公共卫生问题。世界卫生组织（WHO，2020年）将其列为“被忽视的热带疾病”。据估计，肝片吸虫病每年给全球农业社区造成的损失超过30亿美元（Andrews等人，2022年）。主要存在于温带地区，而则主要分布在热带地区，在那里它与共存甚至发生杂交（Calvani和?lapeta，2021年）。
Calvani和?lapeta（2022年）总结了在不同宿主物种中的生命周期和感染性。与相比，关于的结构和发育的基础研究较为匮乏。特别是对于寄生虫在胆管前的发育阶段了解甚少，因为从大量宿主肝脏组织中分离出微小的迁移幼虫在技术上具有挑战性。在实验动物中建立感染模型也比更为困难，且成功率因宿主和寄生虫株而异（Calvani和?lapeta，2022年）。出于动物福利考虑，单个啮齿动物只能短时间容纳少量寄生虫。将体外释放并穿透组织的幼虫通过腹腔注射到小鼠和大鼠体内，为的研究提供了有用的实验材料，感染率在感染4周时可达40%，而口服感染的小鼠感染率仅为7.5%（Hanna和Jura，1976年）。最近有研究报道昆明鼠适合作为感染的模型宿主（通过口服途径），并对其病理学、生物化学和免疫反应进行了研究（Mei等人，2022年）。
物种在迁移过程中的快速而短暂的脱囊、肠道穿透和肝脏定位阶段，主要得益于其幼虫体内的结构适应性变化，例如幼虫肠道盲肠中储存的分泌颗粒（用于肠道穿透过程，Bennett，1975a），以及表皮中的T0分泌体（在肝脏入侵早期维持表面糖萼结构，Bennett和Threadgold，1975年；Hanna等人，2019a）。在中，通过细胞化学染色发现新脱囊和体外穿透的幼虫表面存在一层由T0分泌体胞吐形成的厚黏多糖囊，这层黏多糖囊代表了糖萼的外层结构（Hanna等人，2019b）。
当幼虫开始在最终宿主的肝脏组织中迁移时，产生T0分泌体的表皮下周细胞会逐渐转变为T1表皮细胞，随后T0分泌体会从表面合胞体中消失，被T1分泌体取代（Bennett和Threadgold，1975年；Robinson等人，2022年）。中也观察到了类似的从T0到T1的分泌转变（Hanna等人，2019a）。T1分泌体呈球形，密度均匀且比T0分泌体小，通过胞吐作用从合胞体顶端膜释放，其内容物参与糖萼的形成，而它们的边界膜则整合到顶端膜中。糖萼主要由糖蛋白组成，具有免疫原性，能与宿主免疫球蛋白结合。寄生虫通过胞吐T0和T1分泌体不断更新表面糖萼的能力，使其能够通过脱落免疫复合物来逃避宿主的免疫反应（Hanna，1980a；Robinson等人，2022年；Bennett等人，2025年）。与T1分泌体不同，T2分泌体相对透明且呈扁平或盘状。它们在肝脏入侵后1-2周开始出现在幼虫表皮中，但直到后期才显著参与表面膜的形成，可能负责在寄生虫从组织环境适应到液体（胆汁）环境的过程中维持膜的结构和功能（Hanna，1980b；Robinson等人，2022年）。
物种的相对较长的潜伏期（约为8周，Sangster等人，2022年；约为12-13周，Calvani和?lapeta，2022年）得益于一系列生物活性蛋白的表达和分泌，如溶组织酶和免疫调节因子（Cwiklinski等人，2022年）。其中许多蛋白仅在组织迁移阶段发挥作用，可能是潜在的疫苗候选分子（Spithill等人，2022年综述）。牛和羊接种单种蛋白后可以获得对的良好免疫力（Toet等人，2014年；Molina-Hernández等人，2015年），一些疫苗研究表明幼虫在牛和羊的腹腔或肝实质中被杀死（Dalton等人，1966年；Roberts等人，1997年；Piacenza等人，1999年）。在具有抗感染能力的印度尼西亚细尾羊中，幼虫在感染后2周内即被杀死（Roberts等人，1997年）。了解寄生虫在组织迁移阶段的结构变化有助于寻找这一关键时期宿主-寄生虫关系建立过程中的分子（如转录组、蛋白质组和糖组）关联。
本研究首先对体外释放并穿透组织的幼虫的表皮进行了结构和细胞化学研究（Hanna等人，2019a；Hanna等人，2019b），随后扩展到了从实验感染小鼠的肝实质中收集的迁移和发育中的幼虫。重点研究了幼虫表皮特有的分泌活动（Bennett等人，1982年），以及表皮结构的变化，这些变化可能与寄生虫对受损宿主组织环境的营养和免疫挑战的适应有关。
一般信息
1975年，肯尼亚Muguga的东非兽医研究组织进行了幼虫的培养、体外脱囊和穿透、小鼠感染、幼虫收集、固定及电子显微镜观察等工作。感染前的麻醉、实验小鼠的饲养和安乐死均按照当时肯尼亚的动物福利法规进行。树脂块干燥后密封保存。
亚合胞区
从感染小鼠的肝组织中提取的4周和7周龄幼虫表皮由表层细胞质合胞体组成，该合胞体下方是多层体细胞，这些体细胞通过细胞质纤维与位于肌肉层下方的核化表皮细胞相连。在这一“亚合胞”区域，根据细胞质中是否存在T1型、T2型或T3型分泌体，可以区分出三种不同的分泌细胞类型。
T1和T2分泌体
Threadgold（1963年、1967年）和Robinson等人（2022年）的研究表明，成虫的表皮由表面合胞体组成，这些合胞体通过细胞质桥与下方的环形和纵向肌肉层相连。合胞体内含有大量T1和T2分泌体，这些分泌体在核化区域的独立周细胞中产生。在新脱囊的幼虫中，仅发现一种类型的分泌体。
CRediT作者贡献声明
Hanna Robert Edmund Barrie：负责撰写、审稿与编辑、原始稿撰写、项目监督、方法学设计、实验设计、数据分析、概念构建。
M.W. Robinson：负责撰写、审稿与编辑、资源提供、数据分析。
G.P. Brennan：负责撰写、审稿与编辑、资源提供、方法学设计、数据分析。
P.-E. Kajugu：负责撰写、审稿与编辑、资源提供、项目监督、方法学设计、数据分析。
C.E. Bennett：负责撰写……
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
我们感谢肯尼亚Muguga东非兽医研究组织寄生虫学部门的R. Ogola先生和E. Wairimu女士提供的专业技术支持，以及AFBI贝尔法斯特分部的C. Carlisle女士、J. McMaw先生和D. Moffett女士在电子显微镜技术方面的协助。同时感谢QUB/AFBI的N. Dobson女士和P. Elliott先生以及AFBI的C. Mason先生提供的帮助和建议。此外，还要感谢Cryo-Electron Microscopy部门的C. Hill博士和S.B. Tzokov博士。
