《Veterinary Parasitology: Regional Studies and Reports》：Standardization of real-time polymerase chain reaction (qPCR) and investigation of
Trypanosoma caninum infection in dogs in Brazil
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犬巴贝斯虫（Trypanosoma caninum）在巴西多地存在较高感染率，本研究开发针对其18S rRNA基因的特异性qPCR引物，检测到349只狗中15.5%感染，高于既往报告。皮肤、淋巴结和血液中DNA检出率分别为10%、3.7%和1.7%，皮肤样本DNA含量最高，但未发现显著临床症状，提示该虫可能被低估。
阿莉森·索萨·费雷拉（Arlyson Sousa Ferreira）| 简娜伊娜·马塞拉·阿松桑·罗莎·莫雷拉（Janaina Marcela Assun??o Rosa Moreira）| 埃韦琳·达·克鲁兹·博阿索尔特（Eveline da Cruz Boa Sorte）| 梅丽莎·哈鲁米·苏米约希（Melissa Harumi Sumiyoshi）| 贝阿特丽兹·席尔瓦·诺盖拉（Beatriz Silva Nogueira）| 瓦莱里娅·雷吉亚·弗兰科·索萨（Valéria Régia Franco Sousa）| 瓦莱里娅·杜特拉（Valeria Dutra）| 阿德里亚娜·阿隆索·诺瓦伊斯（Adriana Alonso Novais）| 卢西亚诺·纳卡扎托（Luciano Nakazato）| 阿莱亚娜·多·邦帕尔托·费雷拉·德·阿尔梅达（Arleana do Bom Parto Ferreira de Almeida）
马托格罗索联邦大学利什曼病实验室（Laboratório de Leishmanioses），地址：费尔南多·科雷亚·达·科斯塔大道2367号，邮编78060-900，库亚巴-马托格罗索州，巴西
摘要
犬锥虫（Trypanosoma caninum）于2009年通过无菌培养从健康犬的皮肤中分离出来。该寄生虫已在巴西的不同地区被发现，研究方法包括培养分离、分子检测和测序。然而，需要更敏感的诊断方法来准确评估其感染率。本研究旨在基于犬锥虫的18S rRNA区域设计一对引物，并利用qPCR技术检测巴西犬只皮肤、血液和淋巴结样本中的该寄生虫。所设计的引物对犬锥虫具有高特异性，且无与其他锥虫的交叉反应。这些引物能够扩增248 bp的片段，并且仅需10个寄生虫拷贝即可检测到其DNA。在分析的349只犬中，有54只（15.5%）呈阳性。犬锥虫感染出现在所有市镇，其中瓦尔泽亚格兰德（Várzea Grande）的感染率最高（37.1%）。寄生虫培养和定量PCR检测的阳性率分别为1.4%和14%。在10%、3.7%和1.7%的犬只中分别从皮肤、淋巴结和血液中检测到寄生虫DNA。犬锥虫的寄生虫载量在皮肤样本中最高，其次是淋巴结和血液，两者之间无显著差异（p = 0.06）。犬锥虫的感染率高于之前的报道，表明该寄生虫的流行程度可能被低估。虽然生物样本中的寄生虫载量较低，但皮肤样本中检测到的DNA拷贝数最多，这进一步证实了皮肤作为感染部位的优先性，同时也解释了感染犬只临床表现较少见的现象。
引言
锥虫是一类能够感染脊椎动物和无脊椎动物的原生动物。在已知感染犬类的锥虫种类中，克鲁兹锥虫（Trypanosoma cruzi和埃万西锥虫（Trypanosoma evansi）较为突出（Maggi和Kr?mer，2019；Dario等人，2022）。然而，也有新物种的报道，需要对其流行病学、可能的传播媒介和分布进行进一步研究（Nascimento等人，2022）。2009年，在里约热内卢市，通过无菌培养分离出一种新的锥虫物种，命名为犬锥虫（T. caninum（Madeira等人，2009）。自首次发现以来，犬锥虫已在巴西六个州被报道（Almeida等人，2010；Pinto等人，2010；Barros等人，2012；Oliveira等人，2015）。
目前对犬锥虫
的生物学特性、致病机制、流行病学及精准诊断的认识仍然有限（Oliveira等人，2018）。由于犬锥虫感染通常无症状，且迄今仅从完整皮肤组织中分离到该寄生虫，因此被认为不具有致病性。此外，与其他锥虫属物种相比，犬锥虫无法实验性地感染锥虫媒介（Madeira等人，2009；Barros等人，2012；Madeira等人，2014）。犬锥虫感染的检测依赖于其在无菌培养系统中的分离和扩增，随后通过聚合酶链反应（PCR）和测序进行分子分析（Madeira等人，2009；Almeida等人，2010；Barros等人，2014；Oliveira等人，2018）。尽管这些技术能够检测到这种新锥虫，但它们的灵敏度和特异性较低，可能导致对该寄生虫的流行率估计偏低（Almeida等人，2010）。
分子分析方法可用于诊断不同种类的锥虫感染，无论使用特定还是非特异性靶标（Bono Battistoni等人，2016；Vieira等人，2017；Bui等人，2021）。18S rDNA是目前用于诊断这种新寄生虫的最常用标记物。尽管以往的研究使用通用引物（Barros等人，2015），但本研究专门为犬锥虫设计了引物，从而避免了交叉反应，提高了诊断的特异性。实时定量PCR（qPCR）等分子技术不仅能检测到低水平的病原体，还能准确量化不同组织中的寄生虫载量，这比以往的定性方法更具优势（Echeverria等人，2019）。
犬锥虫与影响犬类的其他锥虫（如婴儿利什曼原虫（Leishmania infantum、巴西利什曼原虫（L. braziliensis和克鲁兹锥虫（T. cruzi））共存，这凸显了开发更敏感和特异性诊断方法的必要性（Almeida等人，2010；Pinto等人，2010；Alves等人，2012；Oliveira等人，2015）。因此，本研究旨在使用针对犬锥虫 18S rRNA区域的寡核苷酸序列来标准化qPCR技术。同时，还调查了巴西中部地区不同市镇犬只的感染率及其相关因素，并检测了犬只皮肤、血液和淋巴结样本中的寄生虫载量，并与寄生虫培养结果进行了比较。
伦理委员会声明
本研究已获得马托格罗索联邦大学动物使用伦理委员会的批准，批准号为23108.068359/2021–14。
犬锥虫
由FIOCRUZ（奥斯瓦尔多·克鲁兹基金会）提供的犬锥虫分离株（R. 2071 - cryo 12,604）在含有NNN双相培养基（Novy, MacNeal, Nicole）和Schneider的试管中培养，并添加了10%的胎牛血清，按照Barros等人（2012）的方案进行扩增。
qPCR标准化
为了标准化犬锥虫 18S rDNA区域的PCR扩增技术，我们进行了温度梯度测试（56°C至70°C），以确定最佳退火温度。结果显示扩增可在66°C以下进行，因此选择60°C作为后续反应的温度。
使用犬锥虫、克鲁兹锥虫（T. cruzi、埃万西锥虫（T. evansi、泰勒锥虫（T. theileri）和婴儿利什曼原虫（L. infantum）的DNA测试了引物的特异性，结果仅犬锥虫的DNA被扩增（见图2）。
讨论
本研究设计的引物对犬锥虫的诊断具有高度特异性，因为它们仅能检测到该寄生虫的DNA，而不会扩增其他锥虫的DNA。这些引物能扩增248 bp的片段，并且仅需10个寄生虫拷贝即可检测到犬锥虫的DNA，同时能够诊断巴西犬只皮肤、血液和淋巴结样本中的感染情况。
通过标准化常规PCR和qPCR等分子技术
结论
本研究开发的引物被证明是诊断犬锥虫的有效且可靠的工具，具有高灵敏度。15.5%的犬只感染了犬锥虫，这一比例高于以往的研究结果，表明该寄生虫的流行程度可能被低估。虽然未发现与感染相关的风险因素，但患有内脏利什曼病的犬只感染寄生虫的风险是其他犬只的2.2倍。
作者贡献声明
阿莉森·索萨·费雷拉（Arlyson Sousa Ferreira）：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、方法验证、研究设计、数据分析、概念框架构建。简娜伊娜·马塞拉·阿松桑·罗莎·莫雷拉（Janaina Marcela Assun??o Rosa Moreira）：初稿撰写、方法设计、数据分析、概念框架构建。埃韦琳·达·克鲁兹·博阿索尔特（Eveline da Cruz Boa Sorte）：研究工作、数据分析。梅丽莎·哈鲁米·苏米约希（Melissa Harumi Sumiyoshi）：研究工作。贝阿特丽兹·席尔瓦·诺盖拉（Beatriz Silva Nogueira）：研究工作。瓦莱里娅·雷吉亚·弗兰科·索萨（Valéria Régia Franco Sousa）：撰写 – 审稿与编辑、资源协调、方法设计。
资金支持
本研究部分得到了马托格罗索州研究支持基金会（FAPEMAT – 221872/2015）的资助。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
作者感谢马托格罗索联邦大学库亚巴分校兽医医院的合作人员，尤其是分子生物学、微生物学和临床病理学实验室的支持。同时，作者也感谢巴西高等教育人员协调委员会（CAPES）和马托格罗索州研究支持基金会（FAPEMAT）提供的奖学金。
