津巴布韦牛泰勒虫病暴发中Theileria物种的分子特征及其遗传多样性研究

《Veterinary Parasitology: Regional Studies and Reports》：Molecular characterization of Theileria species and Theileria parva genetic diversity associated with bovine theileriosis outbreaks in Zimbabwe

Theileria parva及多种蜱媒原虫在津巴布韦牛群中的分子检测与流行病学分析显示，T. parva占63.1%并可能与肯尼亚疫苗株存在基因分化，Boleni疫苗株关联性较低。干血斑和粪便样本检测分别具有59.3%和12.7%的敏感性，为偏远地区防控提供新方法。

　　

V. Pinarello Kleiber | E. Waniwa | D.A. Wilkinson | M. Mutseekwa | V. Grosbois | T. Nemaungwe | E. Kupahwana | T. Chikaka | M. Bourgarel | D.M. Pfukenyi | P.V. Makaya | T. Hove | L. Guerrini | H. De Nys

CIRAD, UMR ASTRE, 哈拉雷, 津巴布韦

摘要

多种Theileria物种感染了东非和南部非洲的牛和野生动物。其中,Theileria (T) parva具有最重要的经济影响,在津巴布韦导致严重的疾病和大量的牲畜损失。最近,theileriosis爆发的时空模式的变化凸显了更新关于循环Theileria物种和菌株的信息的必要性,以便更好地理解感染过程并指导控制策略。2020年11月至2021年5月期间,从Bindura和Makoni地区的158头牛中收集了147份全血样本、145份干血斑样本、87份粪便样本和22份器官样本。样本使用pan-Theileria 18S rRNA和T. parva特异性PCR进行了分析,随后进行了Sanger测序。总体而言,83.3%的病例中检测到了Theileria DNA。物种分布如下:T. parva占63.1%, T. velifera占23.9%, T. taurotragi占2.3%, T. mutans占2.3%,混合感染主要在器官样本中发现。从44份T. parva阳性样本中扩增出了孢子体表面抗原p67的部分序列,从23份样本中扩增出了裂殖子抗原Tp2的部分序列。系统发育分析显示,这些菌株与肯尼亚的Muguga分离株聚类,后者是广泛使用的T. parva疫苗混合物的成分,而不是与津巴布韦的Boleni菌株聚类,这表明它们可能与当地疫苗菌株存在差异。此外,使用18S rRNA PCR对145份干血斑样本和87份粪便样本进行了Theileria检测。与全血样本相比,干血斑样本的PCR检测相对敏感性为59.3%,相对特异性为64.0%,总体相对准确率为60.1%;粪便样本的PCR检测相对敏感性为12.7%,相对特异性为85.7%,总体相对准确率为18.6%。尽管敏感性较低,但非侵入性的粪便采样作为一种创新方法,仍适用于野生动物种群或无法采集血液样本的地区进行监测。虽然这不是本研究的主要目的,但还检测了其他蜱传病原体(E. ruminantium, A. marginale, B. bovis, B. bigemina),以扩展Theileria的研究结果。本研究提供了关于津巴布韦易发疫情地区Theileria物种多样性和T. parva菌株组成的最新见解。这些发现强调了将分子监测整合到常规监测计划中的重要性,以及在评估和采用有效疫苗接种策略时考虑循环菌株多样性的必要性。

引言

Theileria寄生虫是专性细胞内寄生虫,通过蜱虫传播,感染世界许多地区的野生和家养Bovidae动物(WOAH, 2024)。在感染牛的几种Theileria物种中,Theileria (T.) parva在东非、中非和南非最具致病性和经济重要性。它会引起三种牛的疾病综合征:东海岸热(ECF),一种高度急性且常常致命的感染;走廊病(CD),一种与水牛来源菌株相关的严重形式;以及一月病(JD),一种较轻的牛源形式(WOAH, 2024)。这些综合征在流行病学和临床表现上有所不同,但由遗传上无法区分的寄生虫引起(Perry和Young (1993); Mulumba等人(2001); Lawrence等人(2004); Nene等人(2016); Surve等人(2023))。

东海岸热于1901年通过从东非进口的牛引入津巴布韦,并在1954年通过严格的检疫、屠宰和针对媒介Rhipicephalus appendiculatus的浸泡措施成功根除(Lawrence (1991); Uilenberg (1999); Lawrence等人(2004); Latif和Hove (2011))。然而,由牛源T. parva引起的一种较轻形式的感染——一月病仍然存在并呈地方性流行,特别是在集体养殖区,而走廊病则在水牛栖息地附近的野生动物区域零星发生(Norval等人(1992); Latif等人(2002); Morrison等人(2020))。

津巴布韦在20世纪80年代末使用Boleni菌株开发了一种本地疫苗,显示出良好的交叉保护作用和最小的副作用(Kanhai等人, 1997)。然而,由于生产复杂性和可扩展性挑战,以及对疫苗活性的担忧,包括蜱虫传播性和可能导致携带者状态的可能性(Latif和Hove (2011); WOAH (2022)),其采用受到了限制。这类疫苗最好用于没有该疾病的地区。活疫苗,特别是针对Theileria等顶复门寄生虫的疫苗,可能在蜱虫媒介中发生重组,产生毒力增强的重组野外菌株,从而进一步复杂化疾病控制(Latif和Hove (2011); WOAH (2022))。

尽管流行病学模式发生变化且theileriosis爆发增加,但关于循环T. parva菌株的更新分子数据,特别是在Bindura和Makoni等易发疫情地区,仍然有限。这些限制突显了津巴布韦的关键知识空白,包括:缺乏关于循环Theileria物种和菌株的更新分子数据;不确定当前的疫情是否与疫苗菌株存在差异;缺乏经过验证的、适用于偏远地区或野生动物相关区域的可靠寄生虫检测的样本采集和保存策略。这些空白阻碍了基于证据的疫苗接种策略和疫情管理,特别是考虑到Boleni疫苗对可能进化的当地T. parva种群的有效性仍不确定。

为了解决这些知识空白,本研究旨在调查与津巴布韦当前theileriosis疫情相关的Theileria parva的遗传多样性、流行病学特征和诊断考虑。本研究测试了以下假设:津巴布韦当前的theileriosis疫情是由遗传上多样的T. parva菌株引起的,这些菌株可能与Boleni疫苗菌株存在差异;不同的野外样本类型和保存方法在分子检测方面的适用性也各不相同。本研究的具体目标是确定与津巴布韦当前疫情相关的Theileria物种和T. parva菌株,评估它们与历史上的Boleni疫苗菌株的关系,并比较各种样本类型和保存方法在分子检测方面的适用性。虽然不是主要目标,但还机会性地检测了其他常见的牲畜蜱传病原体(Ehrlichia ruminantium, Babesia (B) bovis & B. bigemina, Anaplasma marginale),以扩展Theileria的研究结果。

背景

Theileria寄生虫是专性细胞内寄生虫,通过蜱虫传播,感染世界许多地区的野生和家养Bovidae动物(WOAH, 2024)。在感染牛的几种Theileria物种中,Theileria (T.) parva在东非、中非和南非最具致病性和经济重要性。它会引起三种牛的疾病综合征:东海岸热(ECF),一种高度急性且常常致命的感染;走廊病(CD),一种与水牛来源菌株相关的严重形式;以及一月病(JD),一种较轻的牛源形式(WOAH, 2024)。这些综合征在流行病学和临床表现上有所不同,但由遗传上无法区分的寄生虫引起(Perry和Young (1993); Mulumba等人(2001); Lawrence等人(2004); Nene等人(2016); Surve等人(2023))。

东海岸热于1901年通过从东非进口的牛引入津巴布韦,在牛瘟大流行后于1954年通过严格的检疫、屠宰和针对媒介Rhipicephalus appendiculatus的浸泡措施成功根除(Lawrence (1991); Uilenberg (1999); Lawrence等人(2004); Latif和Hove (2011))。然而,由牛源T. parva引起的一种较轻形式的感染——一月病仍然存在并呈地方性流行,特别是在集体养殖区,而走廊病则在水牛栖息地附近的野生动物区域零星发生(Norval等人(1992); Latif等人(2002); Morrison等人(2020))。

津巴布韦在20世纪80年代末使用Boleni菌株开发了一种本地疫苗,显示出良好的交叉保护作用和最小的副作用(Kanhai等人, 1997)。然而,由于其生产复杂性和可扩展性挑战,以及对疫苗活性的担忧,包括蜱虫传播性和可能导致携带者状态的可能性(Latif和Hove (2011); WOAH (2022)),其采用受到了限制。这类疫苗最好用于没有该疾病的地区。活疫苗,特别是针对Theileria等顶复门寄生虫的疫苗,可能在蜱虫媒介中发生重组,产生毒力增强的重组野外菌株,从而进一步复杂化疾病控制(Latif和Hove (2011); WOAH (2022))。

尽管流行病学模式发生变化且theileriosis爆发增加,但关于循环T. parva菌株的更新分子数据,特别是在Bindura和Makoni等易发疫情地区,仍然有限。这些限制突显了津巴布韦的关键知识空白,包括:缺乏关于循环Theileria物种和菌株的更新分子数据;不确定当前的疫情是否与疫苗菌株存在差异;缺乏在偏远地区或野生动物相关区域进行可靠寄生虫检测的经过验证的、实用的样本采集和保存策略。这些空白阻碍了基于证据的疫苗接种策略和疫情管理,特别是考虑到Boleni疫苗对可能进化的当地T. parva种群的有效性仍不确定。

为了解决这些知识空白,本研究旨在调查与津巴布韦当前theileriosis疫情相关的Theileria parva的遗传多样性、流行病学特征和诊断考虑。本研究测试了以下假设:津巴布韦当前的theileriosis疫情是由遗传上多样的T. parva菌株引起的,这些菌株可能与Boleni疫苗菌株存在差异;不同的野外样本类型和保存方法在分子检测方面的适用性也各不相同。本研究的具体目标是确定与津巴布韦当前疫情相关的Theileria物种和T. parva菌株,评估它们与历史上的Boleni疫苗菌株的关系,并比较各种样本类型和保存方法在分子检测方面的适用性。虽然不是主要目标,但还机会性地检测了其他常见的牲畜蜱传病原体(Ehrlichia ruminantium, Babesia (B) bovis & B. bigemina, Anaplasma marginale,以扩展Theileria的研究结果。

部分章节摘要

背景

津巴布韦的蜱传疾病的流行病学和控制受到媒介管理、宿主分布和季节动态的影响。津巴布韦的蜱虫控制主要依赖于通过浸泡池定期施用杀螨剂,特别是在全国90%以上的牛群所在的集体养殖区。然而,近年来,杀螨剂短缺和兽医监督减少削弱了控制效果,导致theileriosis爆发更加频繁(Latif等人, 2001b)。

伦理声明

动物实验程序得到了津巴布韦国家动物研究伦理委员会(NAREC/009/25)的审查和批准(2025年6月17日批准)。所有动物处理和采样程序均由受过培训的兽医人员按照国家指南和国际伦理标准执行,严格遵守3R原则(替代、减少和优化),以确保在整个研究过程中对动物的人道对待。

研究地点

样本来自

来自牛theileriosis病例的样本

2020年11月至2021年5月期间,在津巴布韦的Bindura (n = 112; 70.9%)和Makoni (n = 46; 29.1%)地区,对158头临床诊断为theileriosis的牛进行了采样。主要观察到的临床症状包括外周淋巴结肿大、发热、食欲不振、流泪和呼吸困难,而尸检发现包括明显的淋巴结肿大,常伴有肺水肿、浆膜和黏膜出血,以及严重病例中的腹腔积液。死亡率

津巴布韦theileriosis的流行病学

蜱传疾病占津巴布韦每年牲畜死亡率的60%以上,其中theileriosis是主要原因。2017年至2022年间,theileriosis爆发急剧增加,导致超过50万头牛死亡(兽医服务部, 2022)。本研究在Bindura和Makoni地区的重新安置区、集体养殖区和小规模养殖区进行了采样,这些地区没有野生动物接触。

结论

研究表明,由牛源Theileria parva引起的一月病仍然是Bindura和Makoni地区的主要theileriosis形式,并记录了其他Theileria物种在牛中的存在。研究还记录了光学显微镜和PCR在Theileria感染检测中的效果。鉴定的牛源T. parva分离株表现出遗传同质性。

这些发现强调了在

CRediT作者贡献声明

V. Pinarello Kleiber: 方法学、调查、验证、数据管理、正式分析、初稿撰写、审稿和编辑。E. Waniwa: 构思、调查、方法学、初稿撰写、审稿和编辑。D.A. Wilkinson: 正式分析、数据管理、软件使用、初稿撰写、审稿和编辑。M. Mutseekwa: 调查。V. Grosbois: 软件使用、审稿和编辑。T. Nemaungwe: 调查、撰写 - 审稿

写作过程中生成式AI和AI辅助技术的声明

在准备本作品时,作者使用了ChatGPT 4.0来提高手稿的可读性和语言表达。使用该工具后,作者根据需要审查和编辑了内容,并对出版物的内容负全责。

资金信息

作者感谢国际农业研究中心(CIRAD)在CAZCOM (N° 2019/88)和PACMAN (N° CZW1019 01 V)项目下的支持,这些项目分别由法国欧洲和外交事务部长FSPI(创新项目团结基金)和法国发展署(AFD)资助。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。

致谢

作者感谢Lovemore Kambewa先生在整个研究过程中对兽医推广人员的培训以及实验室样本检测提供的宝贵帮助。我们感谢位于法国Petit-Bourg (97170)的加勒比地区媒介传播疾病研究与监测中心(CRVC)提供用于本研究的对照DNA样本。