《Applied Microbiology and Biotechnology》：Characterization and genetic diversity of pseudomonads population from highbush blueberry in western Canada
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本研究针对加拿大太平洋西部地区高丛蓝莓细菌性疫病（病原为Pseudomonas syringae complex, Psc）开展系统性调查与病原种群特征解析。通过病原形态学、生化测试（LOPAT）及分子特征（Psy-PCR、多位点测序）对380株假单胞菌分离株进行鉴定，首次发现P. avellanae（29%）和P. viridiflava（20%）为蓝莓细菌性疫病新系统发育种，并揭示Psc种群具有极高遗传多样性（rep-PCR）。该研究为病害诊断、抗病育种及综合防控策略制定提供了关键理论基础。
在加拿大和太平洋西北部地区，高丛蓝莓（Vaccinium corymbosum）作为一种高经济价值的水果作物，正面临一种名为细菌性疫病和溃疡病的严重威胁。这种由丁香假单胞菌复合群（Pseudomonas syringae complex, Psc）引起的病害是地方性流行病，尤其对幼龄蓝莓植株造成毁灭性打击。病原菌侵染花芽，导致茎干顶端出现溃疡和枯死症状，进而向基部蔓延，形成深褐色至黑色的坏死斑。叶片和果实上也会出现斑点和水疱状病变，严重时导致枝条回枯，产量显著下降。病原菌通过伤口、机械损伤或昆虫造成的伤口，以及寄主组织的自然孔口侵入，并在感染的蓝莓组织、果园地被物、落叶和杂草寄主上越冬存活。更棘手的是，P. syringae 能够在无症状的寄主组织上附生（epiphytically）和内生生（endophytically）地生长和存活，在整个生长季节持续存在。其附生种群在夏季高温（超过25°C）时数量会大幅减少，但在秋季气温下降、降雨增多时又会迅速增加。此外，P. syringae 还能在冰冻温度下生存和繁殖，并产生膜结合蛋白，通过冰核活性（ice nucleation）对寄主植物造成冻害，从而利用寄主细胞损伤释放的营养物质促进自身生长和传播。
尽管细菌性疫病在加拿大不列颠哥伦比亚省（BC）及美国华盛顿州和俄勒冈州的高丛蓝莓中广泛存在，但此前对该地区病害的全面调查以及相关病原体的详细特征描述仍属空白。传统的基于寄主来源、生化特征和致病性测定的病原鉴定方法（通常指定为致病变种，pathovar）已不足以在物种或系统发育物种水平上进行精确区分。因此，缺乏对病原种群全面、深入的了解，制约了有效防控策略的制定。为了解决这一知识缺口，研究人员开展了一项为期四年（2017-2020年）的综合性研究，旨在：（i）评估BC省不同种植区多种高丛蓝莓品种中细菌性疫病和溃疡病的流行情况；（ii）从地理和品种多样性角度鉴定和表征大量假单胞菌分离株；（iii）阐明蓝莓感染假单胞菌的种群系统发育物种组成及其遗传多样性。
本研究发表在《Applied Microbiology and Biotechnology》杂志上。为了达成研究目标，研究人员在BC省低陆平原地区和温哥华岛的10个不同地理区域的32个研究和商业蓝莓园进行了病害监测，共从283个具有症状的植物样本中分离到380株假单胞菌。样本来源涵盖了15个不同成熟期的高丛蓝莓品种。关键技术方法包括：利用King‘s B（KB）和补充培养基（KBC）进行病原菌分离和荧光特性鉴定；使用P. syringae特异性引物（Psy-PCR）进行分子初步筛查；通过LOPAT（利凡醇产生、氧化酶活性、果胶分解活性、精氨酸双水解酶活性、烟草过敏反应）测试进行生化表征；利用rep-PCR（BOX和ERIC）进行遗传指纹图谱分析以评估遗传多样性；通过扩增和测序四个看家基因（cts, rpoD, gapA, gyrB）进行多位点序列分析，以确定系统发育物种；并在离体蓝莓叶片上进行致病性测定以验证菌株的致病力。
病害监测与病原分离
研究发现，在2017年至2020年期间监测的蓝莓园中，有88%的园区发现了细菌性疫病症状。从283个病样中共获得380个荧光假单胞菌分离株。其中，72%的分离株在选择性培养基KBC上产生荧光，52%的分离株Psy-PCR检测呈阳性。病害在所有调查的15个品种上均有发生，其中Draper和Aurora品种的假单胞菌阳性样本比例最高。
生化表征（LOPAT测试）
对100个分离株（包括97个本研究分离株和3个参考菌株）进行了LOPAT生化测试。结果显示，69%的分离株具有典型的假单胞菌Ia群（L+O-P-A-T+）模式，即利凡醇产生阳性、氧化酶阴性、无果胶分解活性、精氨酸双水解酶阴性、烟草过敏反应阳性。绝大多数（96%）具有典型LOPAT模式的分离株同时也是Psy-PCR阳性。其余31%的分离株呈现非典型LOPAT模式，其中71%为Psy-PCR阴性。致病性测定表明，典型LOPAT模式的分离株中87%具有致病性，而非典型模式分离株的致病性比例较低。
系统发育物种鉴定
通过对Psy-PCR阳性分离株（n=197）的看家基因（cts和rpoD）进行测序和系统发育分析，研究人员将154个高质量序列的分离株划分为四个系统发育物种：P. syringae（占40%）、P. avellanae（占29%）、P. viridiflava（占20%）和系统发育物种A（占7%）。其中，P. avellanae和P. viridiflava是首次被报道引起高丛蓝莓细菌性疫病的新系统发育物种。系统发育树分析证实了这些分类，并且使用四个看家基因（cts, rpoD, gapA, gyrB）对子集菌株的分析得出了相同的结果，支持了分类的可靠性。不同系统发育物种的地理分布和品种偏好存在差异，例如，P. viridiflava绝大多数（93%）分离自温哥华岛的Draper品种。
遗传多样性分析（rep-PCR）
利用BOX-PCR和ERIC-PCR对116个分离株进行遗传指纹图谱分析，揭示了假单胞菌种群具有极高的遗传多样性，共产生126种独特模式，归属于90个遗传簇。然而，rep-PCR指纹图谱未能清晰区分不同的系统发育物种。对特定地点（如Delta和Surrey）和品种（如Draper）的进一步分析表明，虽然存在一定的地理或品种内聚类趋势，但种群遗传结构复杂，没有形成严格的按地理位置或品种区分的单一克隆系。
致病性测定
对50个分离株进行的致病性测定显示，80%的测试菌株能够引起蓝莓叶片产生深褐色坏死斑，表现为致病性。在不同系统发育物种中，P. viridiflava和系统发育物种A的所有测试菌株均具有致病性，P. syringae和P. avellanae的致病菌株比例分别为80%和67%。
本研究通过全面的调查和多种技术方法的综合运用，首次系统揭示了加拿大西部高丛蓝莓细菌性疫病的病原多样性。研究不仅确认了P. syringae是主要病原，更重要的是发现了P. avellanae和P. viridiflava这两个新的系统发育物种也是该病害的致病菌，这更新了人们对蓝莓细菌性疫病病原组成的认知。研究还揭示了病原种群具有极高的遗传多样性，且这种多样性分布与地理区域和蓝莓品种存在一定关联，但未形成严格的专化性。
该研究的结论具有重要的理论和实践意义。在理论层面，它深化了对Psc种群生物学、遗传结构和进化动态的理解，为植物病原细菌的生态学、适应性进化及宿主-病原互作研究提供了宝贵资料。在应用层面，研究结果为蓝莓细菌性疫病的准确诊断（例如，开发针对新病原物种的特异性检测方法）奠定了坚实基础。对病原种群遗传多样性和系统发育物种组成的深入了解，对于指导抗病品种选育、评估病原菌的潜在演化风险至关重要。此外，这些发现也有助于制定更具针对性的病害综合管理策略，例如，考虑不同系统发育物种可能存在的生态位差异和抗药性风险，从而更有效地控制病害，保障高丛蓝莓产业的可持续发展。
