《Current Microbiology》：Comparison of ESKAPE Pathogen Levels in Wastewater and Receiving Water Bodies Using Agar-Based Enumeration and Real-Time PCR
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本研究针对ESKAPE多重耐药病原体在废水处理系统及环境水体中的传播问题，结合琼脂培养计数与实时荧光定量PCR(RT-PCR)技术，系统评估了南非6座污水处理厂(WWTPs)对Enterococcus faecium、Staphylococcus aureus、Klebsiella pneumoniae和Acinetobacter baumannii等关键病原体的去除效能。研究发现，尽管常规处理能显著降低病原体负荷，但出水和下游水体中仍可检测到残留病原体，尤其以K. pneumoniae和E. faecium的持续性最为突出。该研究为完善基于废水的抗菌素耐药性(AMR)监测策略及修订水质标准提供了关键数据支撑。
在当今全球公共卫生领域，抗菌素耐药性（AMR）的蔓延已成为一项严峻挑战。其中，ESKAPE病原体——包括粪肠球菌（Enterococcus faecium）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）、鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）和肠杆菌属（Enterobacter spp.）——因其强大的“逃逸”抗生素杀伤的能力而备受关注。这些微生物不仅是医院内感染的主要元凶，更令人担忧的是，它们正越来越多地在临床环境之外被发现，尤其是城市废水处理厂（WWTPs）及其排放的受纳水体中，这引发了关于常规废水处理工艺效能及其可能成为抗菌素耐药性扩散热点的深刻忧虑。
传统观点认为，废水处理过程能有效去除病原微生物。然而，近年研究显示，ESKAPE病原体可能绕过处理屏障，最终污染河流、湖泊等环境水体，对生态安全和公众健康构成潜在威胁。以往研究多聚焦于临床分离株，或仅针对ESKAPE群体中的个别物种，缺乏在环境介质中对其整体存在水平、分布规律及污水处理厂去除效率的系统评估。此外，环境微生物监测长期依赖传统的培养方法，该方法仅能检测可培养的活菌，可能低估了包括不可培养但仍具潜在风险的病原体在内的真实微生物负荷。分子生物学技术，如实时荧光定量PCR（RT-PCR），虽能弥补培养法的不足，直接检测特定遗传标记，但将这两种技术结合用于全面评估废水及环境中ESKAPE病原体的研究尚不充分。
在此背景下，发表于《Current Microbiology》的研究论文《Comparison of ESKAPE Pathogen Levels in Wastewater and Receiving Water Bodies Using Agar-Based Enumeration and Real-Time PCR》应运而生。该研究旨在通过整合培养依赖（琼脂计数法）和培养非依赖（RT-PCR）两种方法，精确量化南非西北省和豪登省选定的六座污水处理厂及其下游受纳水体中ESKAPE病原体的浓度，并评估其去除效率，以更全面地揭示这些多重耐药（MDR）生物在环境中的命运。
为达成研究目标，作者团队开展了一项细致的现场采样与实验室分析工作。研究的关键技术方法主要包括：
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样本采集与处理：研究于2022年3月至7月（南非秋冬季节）在南非西北省和豪登省的6座污水处理厂（WWTP B, D, F, I, J, K）进行。采集点包括进水（Influent）、出水（Effluent）以及下游受纳水体（Downstream）样品。部分污水处理厂因电力中断（负荷削减）导致无法正常运作或无法获取全部类型样品。水样使用无菌瓶采集后，冰上运输至实验室，并在24小时内完成过滤（使用0.4微米孔径滤膜）。
- 2.
病原体检测与定量：
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培养依赖方法（琼脂计数法）：使用针对六种ESKAPE病原体的选择性培养基进行培养和菌落计数（CFU/100 mL），并对分离株进行16S rRNA基因测序验证。
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培养非依赖方法（实时荧光定量PCR, RT-PCR）：从滤膜提取环境DNA（eDNA），利用特异性引物通过SYBR Green法的RT-PCR技术定量检测四种ESKAPE病原体（E. faecium, S. aureus, K. pneumoniae, A. baumannii）的特异性基因。通过标准曲线进行绝对定量，并将目标基因拷贝数归一化到16S rRNA基因拷贝数以进行相对丰度比较。
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数据分析：计算病原体在污水处理厂中的去除效率百分比，并利用热图、散点图等统计方法分析病原体丰度在不同采样点、不同季节间的变化规律和关联性。
研究结果
ESKAPE病原体水平：培养法与RT-PCR法的揭示
通过琼脂培养计数法，在所有研究的污水处理厂进水中均检测到了所有六种目标ESKAPE病原体。其中，肠杆菌属（Enterobacter spp.）最为丰富，而鲍曼不动杆菌（A. baumannii）的检出率最低。病原体浓度在进水中最髙，处理后普遍下降，但不同污水处理厂和季节间存在显著差异。例如，WWTP F和K显示出最高的病原体负荷和多样性，其进水浓度经常超过6 log10CFU/100 mL。操作挑战（如WWTP F因停电非正常运行）显著影响了病原体的排放模式。
相比之下，RT-PCR技术成功量化了E. faecium、S. aureus、K. pneumoniae和A. baumannii这四种病原体。RT-PCR结果显示，肺炎克雷伯菌（K. pneumoniae）是优势菌种。与培养法一致，RT-PCR也显示进水中的病原体浓度最高，处理后降低。然而，分子方法在出水和下游样本中显示出更高的检出率，提示常规处理方法未能完全清除这些病原体，部分以可存活但不可培养（VBNC）状态或游离DNA形式存在。
两种方法比较：互补的价值
研究对培养法和RT-PCR在冬季干燥季节的检测效果进行了比较。总体而言，RT-PCR对E. faecium、K. pneumoniae和A. baumannii的检测灵敏度更高，尤其在出水和下游样本中。例如，A. baumannii的培养法检出率仅为26.7%，而RT-PCR达到80%。对于S. aureus，两种方法的检出率相近。然而，铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）和肠杆菌属（Enterobacter spp.）仅被培养法检出，这主要是由于本研究中RT-PCR未包含针对这两种菌的特异性引物所致。这一对比突显了联合使用两种方法可以更全面地评估微生物污染情况，避免单一方法的局限性。
ESKAPE病原体的分布模式与持久性
通过热图对四种RT-PCR定量病原体的相对丰度进行分析，揭示了特定的分布模式。聚类分析显示，E. faecium和A. baumannii的丰度模式相似，而K. pneumoniae和S. aureus聚为另一类。采样点则大致按进水/出水点和下游点聚类，下游点进一步细分，表明排放后病原体的持久性或再生长存在变异性。值得注意的是，在某些功能受限的污水处理厂（如WWTP B和F），下游点出现了病原体浓度的异常升高或再增长，表明处理效率低下或存在其他污染源输入。
污水处理厂去除效率评估
利用RT-PCR数据计算了四种ESKAPE病原体在功能正常的污水处理厂（B, D, J, K）中的去除效率。总体而言，污水处理厂显示出显著的病原体去除能力。金黄色葡萄球菌（S. aureus）和鲍曼不动杆菌（A. baumannii）在多个厂（B, D, J）达到了100%的去除效率（未在出水中检出）。肺炎克雷伯菌（K. pneumoniae）的去除效率在90.3% (WWTP D) 到 99.7% (WWTP B) 之间。粪肠球菌（E. faecium）的去除效率在88.6% (WWTP J) 到 95.5% (WWTP K) 之间，但WWTP B出现了出水中E. faecium浓度高于进水的异常情况（无减少，NR）。最低的去除效率出现在WWTP K对S. aureus的去除，仅为54.1%。尽管去除效率总体较高，但RT-PCR检测表明，部分病原体仍残留在出水中并进入下游环境。
研究结论与意义
本研究证实，南非的污水处理厂及其下游环境是ESKAPE病原体的持续储存库，推动了抗菌素耐药性在环境中的传播。尽管常规处理工艺能有效降低病原体负荷，但无法完全消除它们。分子生物学方法（RT-PCR）在检测灵敏度方面优于传统培养法，尤其能揭示出经过处理后水体中仍存在的、可能被低估的微生物风险。
研究结果具有重要的政策启示。当前南非的“绿滴”（Green Drop）水质评估体系主要关注大肠杆菌（E. coli）等指示菌，可能无法全面反映如肺炎克雷伯菌（K. pneumoniae）和粪肠球菌（E. faecium）等具有重要临床意义的多重耐药病原体的存在风险。将ESKAPE病原体纳入常规监测范围，并采纳分子生物学工具进行补充监测，将有助于更准确地评估与废水排放相关的健康风险，并与世界卫生组织（WHO）的抗菌素耐药性监测策略（如Tricycle Protocol）接轨。此外，研究结果也对实现联合国可持续发展目标（SDG）6（清洁饮水和卫生设施）中的具体目标（如6.3改善水质）提出了挑战，强调了需要加强污水处理基础设施，特别是在那些已识别为高风险（如WWTP F和K）的设施，以最大限度地减少耐药病原体向环境中的释放。
综上所述，这项研究强调了在废水管理实践中采取综合监测策略和升级处理技术的必要性，以应对日益严峻的抗菌素耐药性环境传播威胁，对于保障水资源短缺地区（如南非）的公共健康和环境安全至关重要。
