《Current Microbiology》：Isolation of Proteus sp. Closely Related to P. Vulgaris (Vulgaris/hauseri Complex) from Ornamental Koi (Cyprinus rubrofuscus) and its Pathogenicity
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本研究针对马来西亚砂拉越地区观赏锦鲤出现大规模疾病暴发的问题，分离并鉴定主要病原菌。研究人员通过综合表征和分子鉴定，确定病原主要为气单胞菌属(Aeromonas)和变形杆菌属(Proteus)，并重点研究了与普通变形杆菌(P. vulgaris/vulgaris-hauseri复合体)密切相关的变形杆菌分离株I1_3的致病性。实验感染证实该菌可导致锦鲤出现类似自然感染症状，其半数致死剂量(LD50)为1.7×108CFU/mL，组织病理学显示肝肾出现融合、淋巴细胞聚集和坏死等病变。药敏试验表明该菌对多种广谱抗生素敏感。此研究为首例从锦鲤中分离该变形杆菌的报道，为观赏鱼细菌性疾病的防治提供了重要见解。
观赏锦鲤以其独特的色彩图案和高经济价值闻名于世，然而这些“水中活宝石”同样易受多种病原体侵袭，导致高死亡率和高发病率，给观赏鱼养殖业带来显著经济损失。2023年12月，马来西亚砂拉越州古晋某水产养殖场的100多条锦鲤幼鱼出现临床症状，病因不明。为此，研究人员开展了病原鉴定与致病性研究，成果发表在《Current Microbiology》期刊上。
为明确病因，研究团队从自然发病的锦鲤肠道和肾脏中分离细菌，通过形态学观察、生化特性分析（VITEK? 2 GN鉴定卡）和16S rRNA基因测序进行鉴定。扫描电子显微镜(SEM)观察细菌形态。随后，以健康锦鲤幼鱼为模型，通过腹腔注射不同浓度的I1_3菌株进行实验性感染，计算半数致死剂量(LD50)，并利用Probit分析处理数据。通过柯赫氏法则(Koch's postulates)重新分离并分子验证病原。取感染鱼和对照鱼的肾脏和肝脏组织，经4%多聚甲醛固定、蔗糖梯度脱水、冰冻切片及H&E（苏木精-伊红）染色后进行组织病理学分析。采用VITEK? 2 Compact系统进行抗生素敏感性测试。数据统计分析采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)和Tukey's HSD（诚实显著性差异）检验。
细菌分离与鉴定
自然发病锦鲤表现为失衡游动、昏睡、出血、鳞片脱落和皮肤淤血样变色。从内脏分离的菌落形态多样，其中一株纯化菌在LB（溶菌肉汤）琼脂上呈现明显的同心圆“牛眼”样迁徙生长现象。革兰氏染色显示所有分离菌均为红色或粉红色染色的杆状菌，单排列，确认为革兰氏阴性菌。VITEK? 2鉴定和16S rRNA基因测序（约1500 bp）结果表明，分离菌主要属于气单胞菌属(Aeromonas)和变形杆菌属(Proteus)。分离株I1_3经鉴定与普通变形杆菌(Proteus vulgaris/vulgaris-hauseri复合体)密切相关，其16S rRNA序列与Proteus sp. NT_S71F等高度相似，系统发育分析显示其与Proteus sp. ATCC 51470以100%的 bootstrap（自举法）支持度聚为一支，但分支较长，提示可能存在菌株水平变异。扫描电镜证实I1_3为杆状，表面相对光滑完整。
I1_3分离株的实验性感染、柯赫氏法则验证与组织病理学
实验感染显示，不同浓度菌液感染组的累积死亡率存在显著差异(p < 0.01)，LD50为1.7×108CFU/mL。高浓度菌液感染的鱼症状更严重，包括红肛综合征、腹水、出血、鳃丝苍白和肠道胀气；低浓度感染鱼则出现眼部病变、鳞片脱落和体表覆盖黏液层等症状，其中鳞片脱落和出血与自然发病锦鲤症状一致。柯赫氏法则验证：从人工感染发病鱼的肠道中重新分离到细菌，经16S rRNA测序证实为同一变形杆菌。组织病理学分析显示，感染鱼肾脏组织出现嗜碱性细胞团和肾小管扩张；肝脏组织出现淋巴细胞聚集并伴有肝细胞坏死。
抗生素敏感性分析
I1_3菌株对测试的19种抗生素中的多种表现出耐药性，包括氨苄青霉素、氨苄青霉素/舒巴坦、头孢呋辛、头孢呋辛酯、头孢曲松和亚胺培南，但对哌拉西林/他唑巴坦、头孢他啶、头孢他啶/阿维巴坦、头孢洛扎/他唑巴坦、头孢吡肟、多利培南、厄他培南、美罗培南、阿米卡星、庆大霉素、环丙沙星和甲氧苄啶/磺胺甲恶唑等敏感，提示其为多重耐药(MDR)菌，但对多数广谱抗生素仍敏感。
本研究成功从患病锦鲤中分离并鉴定出与普通变形杆菌(vulgaris/hauseri复合体)密切相关的变形杆菌I1_3，证实其作为机会性病原体对锦鲤具有致病性，可能与气单胞菌发生共感染，加剧疾病严重程度。研究明确了该菌的LD50及引起的典型组织病理变化，并完成了柯赫氏法则验证。抗生素敏感性结果为临床治疗提供了重要参考。该研究为首例从锦鲤中分离并系统研究此类变形杆菌的报道，强调了在观赏鱼养殖中需关注除气单胞菌外的其他潜在病原体，对制定综合疾病防控策略、保障观赏鱼养殖业的健康可持续发展具有重要意义。未来研究应关注共感染动态、自然感染途径（如浸泡攻毒）以及开发有效疫苗和替代疗法以应对抗生素耐药性。
