《Scientific Reports》：A novel variant p.Y250C of FZD4 influences Norrine/β-catenin signaling pathway that associates with familial exudative vitreoretinopathy (FEVR)
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本研究聚焦于家族性渗出性玻璃体视网膜病变（FEVR）的致病机制，针对FZD4基因新型错义突变c.A749G（p.Y250C）展开功能验证。研究人员通过荧光显微镜、免疫共沉淀（Co-IP）及报告基因等技术，发现该突变导致FZD4蛋白在核膜和核内异常聚集，并显著减弱Norrin/β-catenin信号通路活性，降低p-β-catenin（Ser552）和VEGF-A表达。该研究首次从分子层面揭示p.Y250C变异的致病性，为FEVR的基因诊断和靶向治疗提供理论依据。
在遗传性眼病领域，家族性渗出性玻璃体视网膜病变（Familial Exudative Vitreoretinopathy, FEVR）犹如一个潜伏的视觉杀手，其特征是视网膜血管发育异常，患者从轻微周边血管缺失到严重视网膜脱离均可能发生。尽管已知超过18个基因与FEVR相关，但FZD4（Frizzled-4）、LRP5（Low-density lipoprotein receptor-related protein 5）、NDP（Norrin cystine knot growth factor）和TSPAN12（Tetraspanin-12）这四个构成Norrin/β-catenin信号通路核心的基因，承载着近半数FEVR患者的致病突变。特别值得注意的是，FZD4基因突变在FEVR患者中检出率最高，但不同突变导致的临床表现差异巨大，其背后的分子机制仍如迷雾般亟待揭开。
西南医科大学研究团队在前期工作中，从一个中国FEVR家系中首次发现FZD4基因存在c.A749G（p.Y250C）新型杂合变异，该变异位于蛋白质第一细胞内环的酪氨酸残基（Y250），在物种进化中高度保守。然而，这个变异究竟是致病的"元凶"还是无害的"旁观者"，需要功能实验的严密验证。《Scientific Reports》最新发表的研究正是针对这一科学问题展开的深入探索。
研究人员采用了一套精密的分子生物学技术组合拳：通过位点特异性突变技术构建突变型FZD4（FZD4-MUT）质粒；利用荧光显微镜观察蛋白亚细胞定位；采用免疫共沉淀（Co-IP）分析蛋白相互作用；通过β-catenin报告基因（TOP-Flash/FOP-Flash）检测信号通路活性；借助蛋白质印迹（Western blot）评估下游信号分子表达。实验以人宫颈癌HeLa细胞为模型，同时分析了Fzd4蛋白在小鼠不同组织和发育阶段的表达谱。
3.1 时空表达分析揭示Fzd4在早期视网膜发育中的关键角色
研究人员首先绘制了Fzd4蛋白在小鼠体内的表达图谱。结果显示，Fzd4在脑组织、视网膜（特别是出生前一周的胎鼠眼组织）、子宫、肾脏和肝脏中高调表达，而在其他组织中几乎检测不到。更重要的是，Fzd4在出生前一周的胎鼠眼组织和新生鼠眼组织中均有表达，但在其他发育阶段的视网膜或其他眼组织中表达缺失。这一发现暗示Fzd4主要在视网膜和眼部发育的早期阶段发挥作用，与其在血管形成中的关键角色高度吻合。
3.2 精准构建FZD4突变体质粒
研究团队成功利用限制性内切酶EcoR V酶切和连接技术，将包含c.A749G突变的DNA片段替换野生型FZD4（FZD4-WT）质粒中的对应区域，经PCR和测序验证，获得仅在该位点存在差异的FZD4-MUT质粒，为后续功能比较研究奠定基础。
3.3 突变FZD4显著削弱β-catenin信号通路活性
报告基因实验结果显示，转染FZD4-MUT的HeLa细胞中β-catenin报告活性（0.0260±0.0096）显著低于野生型组（0.0992±0.0160），降低约74%（p<0.05）。这一结果表明p.Y250C突变严重损害了FZD4介导的Norrin/β-catenin信号通路转导功能。
3.4 突变FZD4与LRP5的结合关系保持不变
免疫共沉淀实验发现，无论是野生型还是突变型FZD4，均能与LRP5正常结合，且与NDP的相互作用也未受影响，说明该突变并不破坏FZD4/LRP5/NDP受体复合体的形成。然而，TSPAN12在两组中均未检测到相互作用，提示在该实验条件下TSPAN12可能不直接参与该核心复合体。
3.5 突变FZD4异常聚集于核膜和核内
亚细胞定位分析呈现惊人发现：野生型FZD4主要定位于细胞质和细胞膜，呈现明亮的点状绿色荧光；而突变型FZD4则倾向于在核膜和核内聚集。统计显示，突变型FZD4进入细胞核的比例（66.7%）显著高于野生型（23.6%），表明p.Y250C突变改变了FZD4的正常细胞内分布。
3.6 突变FZD4影响下游信号分子表达
蛋白质印迹分析显示，在FZD4-MUT条件下，尽管总β-catenin水平无显著变化，但磷酸化β-catenin（p-β-catenin，Ser552）和血管内皮生长因子A（Vascular Endothelial Growth Factor A, VEGF-A）的表达均明显降低。无论是由NDP还是RSPO1（R-Spondin 1）激活通路，突变型FZD4均表现出信号转导能力减弱。
本研究得出结论：FZD4基因新型错义突变c.A749G（p.Y250C）通过双重机制导致FEVR发病。一方面，突变蛋白异常定位至核膜和核内，破坏正常 trafficking（运输）；另一方面，尽管保持与LRP5的结合能力，却显著减弱Norrin/β-catenin信号通路活性，影响下游靶基因表达。特别值得注意的是，该突变特异性降低p-β-catenin（Ser552）水平，而该位点磷酸化原本促进β-catenin核内聚集和转录活性，这一发现为理解FEVR分子机制提供新视角。
研究团队在讨论中指出，虽然突变蛋白的核内聚集机制尚未完全阐明，可能与错误折叠和内质网滞留有关，但这一现象本身具有重要病理意义。同时，研究也承认使用HeLa细胞而非视网膜特异性模型的局限性，以及未能进行血管生成功能验证（如血管形成实验）的不足。然而，这并不影响该研究首次从功能层面证实p.Y250C变异的致病性，为FEVR的遗传咨询和精准医疗提供重要科学依据。随着对Norrin/β-catenin信号通路认识的深入，针对该通路的新型治疗策略或许能为FEVR患者带来曙光。
