《Nature Communications》：A general one-step protocol to generate impermeable fluorescent HaloTag substrates for in situ live cell application and super-resolution imaging
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本研究针对现有荧光HaloTag配体因细胞膜渗透性而无法特异性标记膜表面蛋白的难题，开发了一种通用的一步式磺化修饰策略，成功将多种高性能染料（如TMR-d12、SiR-d12、NBD等）转化为细胞不可渗透的SHTL底物。该策略通过直接在HTL连接臂引入磺酸基团，在不影响染料光物理性质的前提下实现精准膜表面蛋白标记，并在神经元模型中通过STED超分辨成像揭示了代谢型谷氨酸受体mGluR2的突触前定位特征，为研究GPCR空间分布提供了重要工具。研究成果发表于《Nature Communications》。
在生命科学研究中，精确可视化特定蛋白质的时空分布是理解其功能的关键。自标记蛋白标签（Self-labelling protein tags, SLPs）如SNAP-tag和HaloTag蛋白（HaloTag Protein, HTP）的发展，使研究人员能够将荧光染料特异性地标记到目标蛋白上，从而在活细胞中进行实时观测。然而，当研究焦点集中于细胞表面受体——这类介导细胞间信息传递的关键分子时，传统方法面临一个突出挑战：常用的高性能荧光染料往往能够自由穿过细胞膜，导致细胞内外（包括内体/溶酶体及内质网中）的蛋白群体被同时标记，无法区分位于细胞膜表面的、具有功能活性的受体池。
为解决这一问题，通常的策略是直接对染料分子进行化学修饰，例如引入带负电的羧酸基或磺酸基，以增加其亲水性，使其无法穿透细胞膜的脂质双层。虽然已有研究成功开发出此类不可渗透的染料变体（如JF635i、Sulfo549/Sulfo646），但这些方法需要对染料核心结构进行定制化合成，步骤繁琐，缺乏普适性，且难以快速应用于各类新兴高性能染料。此外，对于HaloTag系统，由于其配体（HaloTag Ligand, HTL）的离去基团是氯离子，无法像SNAP-tag系统那样通过修饰离去基团本身来引入电荷，这限制了通用型不可渗透HaloTag底物的开发。
在此背景下，来自莱布尼茨分子药理研究所（Leibniz-Forschungsinstitut für Molekulare Pharmakologie, FMP）的Johannes Broichhagen团队及其合作者在《Nature Communications》上发表了一项研究，提出了一种简单、通用的解决方案。他们不再拘泥于修饰染料本身或离去基团，而是巧妙地将一个带负电的磺酸基团安装在了连接染料与HaloTag配体的酰胺键（或胺基）上。这种名为“染料-SHTL”（染料穿梭体）的新型探针，成功地将多种高性能染料（包括罗丹明类的TMR-d12、SiR-d12以及结构迥异的NBD染料）转化为细胞不可渗透的形式，实现了对细胞表面蛋白的高特异性标记。
研究人员为开展此项研究，主要依托以下几项关键技术方法：首先，他们利用分子对接模拟验证了磺化连接臂与HaloTag蛋白的兼容性；其次，建立了一步化学磺化反应 protocol，可高效地将商业或自研的染料-HTL底物转化为SHTL形式，并可通过体外蛋白质谱和荧光偏振分析验证其标记效率和动力学；再者，利用表达特定跨膜构建体（如SNAP-TM-HTP）的HEK293T细胞模型，通过共聚焦显微镜直观验证了SHTL探针的膜不透性；最后，他们将此技术应用于更复杂的生物学系统——通过慢病毒转导在原代海马神经元中表达HTP-mGluR2（代谢型谷氨酸受体2），并结合免疫荧光标记（针对MAP2、Bassoon、Shank等突触标志物）以及STED（受激发射损耗）超分辨成像技术，精确解析了mGluR2在神经元表面，特别是突触前区域的纳米级定位。
研究结果
Launching SHTL: Sulfonation of fluorescent HaloTag Ligands
研究人员首先通过分子对接模拟证实，在HTL连接臂上引入带有磺酸基的C3 linker不会在空间上阻碍染料在HaloTag蛋白表面的暴露。随后，他们建立了一步磺化反应：将染料-HTL底物（如TMR-d12-HTL、SiR-d12-HTL）溶于DMF，加入氢化钠（NaH）和1,3-丙烷磺内酯，即可高效（产率>90%）地得到磺化产物TMR-d12-SHTL和SiR-d12-SHTL。光谱分析表明，磺化仅引起染料激发和发射波长的微小偏移，且不影响其与HTP的结合 stoichiometry（化学计量比）和标记动力学（t1/2~50秒）。更重要的是，磺化后染料的量子产率和荧光寿命甚至略有提升，表明其光物理性质未受损害，甚至有所改善。
Cell imaging validates membrane impermeability of dye-SHTLs
为了验证SHTL的细胞膜不透性，研究团队在HEK293T细胞中分别表达了HTP-TM-SNAP（HTP位于胞外，SNAP位于胞内）和SNAP-TM-HTP（SNAP位于胞外，HTP位于胞内）两种跨膜构建体。当用细胞可渗透的BG-JF646标记胞内SNAP，并同时加入TMR-d12-HTL时，观察到强烈的胞内信号，表明HTL探针进入了细胞。相反，使用TMR-d12-SHTL时，荧光信号仅局限于细胞膜，与胞外SNAP标记共定位，且胞内无信号，清晰证明了其膜不透性。将SNAP标签的位置对调后，使用细胞不可渗透的BG-SulfoJF646标记胞外SNAP，TMR-d12-SHTL处理组则几乎检测不到信号，进一步排除了其非特异性渗透的可能性。同样的结果在SiR-d12-SHTL以及后续的NBD-SHTL上也得到验证，表明该策略对不同染料类别均适用。
Expanding the dye-SHTL scaffold and color palette
为了证明SHTL策略的普适性，研究人员将其应用于结构完全不同于罗丹明的硝基苯并二氮杂异恶唑（Nitrobenzodiazaisooxazole, NBD）染料。他们成功合成了NBD-HTL，并通过相同的磺化步骤获得了NBD-SHTL。尽管胺基的烷基化导致其激发光谱发生红移，但其仍能有效标记HTP，并在细胞成像中表现出与罗丹明类SHTL相似的膜不透性特性。这便将SHTL的应用范围扩展到了绿色光谱区域，并证明了该策略适用于胺基连接（而不仅仅是酰胺连接）的配体。
SiR-d12-SHTL reveals differential surface and internal mGluR2 localization in neurons
在证明SHTL探针在细胞系中的有效性后，研究人员将其应用于更复杂的原代小鼠海马神经元系统。他们通过慢病毒转导，使神经元表达HTP融合的代谢型谷氨酸受体2（HTP-mGluR2）。使用SiR-d12-SHTL进行活细胞标记后固定，并进行免疫荧光染色（标记树突MAP2、突触前蛋白Bassoon、突触后蛋白Shank），通过共聚焦显微镜成像。结果显示，与可渗透的SiR-d12-HTL（标记所有胞内和胞外受体）相比，SiR-d12-SHTL处理组的神经元胞体区域荧光信号显著降低，剩余的荧光信号主要来自细胞表面以及树突（MAP2阳性）和轴突（MAP2阴性）过程。这表明mGluR2在胞体、树突和轴突均存在大量的胞内群体。更重要的是，通过分析Bassoon和Shank信号共定位的突触位点，发现SiR-d12-SHTL标记的表面mGluR2更倾向于定位于突触前区域（靠近Bassoon），而使用可渗透探针时，由于胞内信号的干扰，这种定位的精确性下降。这凸显了真正的表面标记对于精确定位功能受体池的重要性。
Super-resolution imaging of HTP-mGluR2 at neural processes using SiR-d12-SHTL
得益于SiR-d12优异的STED成像性能，研究人员进一步对神经元进行了STED超分辨成像。结果显示，使用SiR-d12-SHTL可以清晰地分辨出神经元突起表面HTP-mGluR2的分布，其分辨率达到134纳米（半高全宽，FWHM约60-68纳米），远优于共聚焦成像（FWHM约259纳米）。此外，通过结合针对Bassoon的免疫荧光标记，他们成功实现了HTP-mGluR2与Bassoon的双色STED成像，精确展示了受体在突触接触位点的纳米级分布（FWHM约119纳米），证明了SHTL探针与超分辨成像技术结合的强大潜力。
Taming ATTO 647N's stickiness using SHTL
ATTO 647N是一种性能优异但已知具有较强非特异性粘附性的远红色染料。研究人员将其应用于第二代HaloTag配体HTL.2上，并进行了磺化，得到了带有两个磺酸基的ATTO 647N-S2HTL.2。在低表达HTP-SNAP-mGluR2的HEK293T细胞中，他们比较了不同探针在低浓度（1-100 nM）和短时间（10分钟）孵育下的标记效果。结果显示，非磺化的ATTO 647N-HTL在低浓度下标记效率低，高浓度下非特异性背景高；单磺化的ATTO 647N-SHTL非特异性背景有所降低，但表面标记效率仍不理想；而非磺化的HTL.2版本（ATTO 647N-HTL.2）标记效率高，但在高浓度下仍有胞内摄取。最终，双磺化的第二代配体ATTO 647N-S2HTL.2表现最佳，即使在1 nM的极低浓度下，也能实现明亮、特异的细胞表面标记，且背景可忽略不计。这表明将HTL.2与磺化策略结合，能有效改善染料的粘附性问题，适用于低丰度蛋白标记和复杂组织应用。
A one-step protocol to synthesize dye-SHTLs for in situ use
为了最大化该技术的可及性，研究人员开发了一种无需纯化、可直接用于细胞实验的小规模（5 nmol级别）原位合成方案。他们将反应条件优化为使用溶于DMSO的叔丁醇钾（KOtBu）作为碱，液态的1,3-丙烷磺内酯，反应仅需5分钟，淬灭后即可直接稀释用于细胞染色。他们对多种商业（JF549-HTL, JF646-HTL）和自研（TMR-d12-HTL, SiR-d12-HTL）染料进行了测试，反应转化率均>99%。细胞毒性实验表明，适当稀释的反应混合物对细胞活性无影响。使用该方法制备的SHTL探针在细胞成像中表现出与经HPLC纯化的探针相同的性能。
结论与意义
本研究成功开发了一种普适、高效的一步法磺化策略，能够将多种常见的染料-HaloTag配体（HTL）快速转化为细胞不可渗透的形式（染料-SHTL）。该策略避免了繁琐的染料从头合成，直接对现有探针进行后期修饰，极大地降低了技术门槛。研究从化学合成、光物理表征、细胞水平验证，到最终在复杂的原代神经元系统中应用，系统性地证明了SHTL探针在特异性标记细胞表面蛋白方面的卓越性能。特别是在神经科学领域，利用SiR-d12-SHTL结合STED超分辨成像，首次在纳米尺度上清晰揭示了mGluR2在神经元突触前膜的定位特征，这对于理解GPCR的突触组织方式和信号转导机制具有重要意义。此外，该策略成功拓展至第二代HTL.2配体和易粘附的ATTO 647N染料，进一步提升了探针的性能和应用范围。最后，提供的简易原位合成方案使得任何实验室都能方便地制备和使用这些不可渗透探针。这项工作为生命科学领域，尤其是细胞表面受体研究和神经科学的高精度成像，提供了一套强大而便捷的工具箱，有望推动相关领域的快速发展。
