《Nature Communications》：Reversible lipid-mediated pH-gating of connexin-46/50 by cryo-EM
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本研究通过冷冻电镜技术解析了天然Cx46/50间隙连接通道在酸性条件下的结构变化，揭示了脂质渗透至通道孔内驱动N端结构域位移并稳定孔隙闭合的新机制。该发现阐明了细胞在缺血、白内障等应激状态下通过pH调控细胞间通讯的分子基础，为靶向 connexin 相关疾病的治疗策略提供了结构依据。
细胞间的精准通讯是维持组织功能的核心，而间隙连接（gap junction）作为直接连接相邻细胞的通道，在此过程中扮演关键角色。这些由 connexin 蛋白构成的通道允许离子、代谢物和信号分子在细胞间自由穿梭，使组织能够协同应对生理变化。然而，在缺血、炎症或白内障等病理状态下，细胞内酸性环境（pH下降）会触发间隙连接关闭，以阻止毒性物质扩散至健康细胞——这一现象被称为“死亡之吻”（kiss of death）。尽管已知pH门控对细胞保护至关重要，其具体的分子机制数十年来始终模糊不清。
为解开这一谜题，Oregon Health and Science University的Joshua M. Jarodsky、Janette B. Myers和Steve L. Reichow团队在《Nature Communications》发表了最新研究。他们以晶状体中天然存在的Cx46/50通道为对象，利用冷冻电镜（cryo-electron microscopy, cryo-EM）解析了其在酸性与中性pH下的高分辨率结构，首次捕捉到脂质分子参与pH门控的动态过程，并证明该过程完全可逆。
研究团队通过以下关键技术展开探索：首先从绵羊晶状体组织中提取天然Cx46/50蛋白，将其重构至含有DMPC脂质的纳米盘（nanodisc）或两亲性聚合物（amphipol）中；通过凝胶过滤调节pH环境（中性pH 7.4 vs. 酸性pH 5.8），模拟生理与病理条件；利用单颗粒冷冻电镜解析不同pH下的通道结构，结合三维变异性分析（3D variability analysis, 3DVA）和亚基分类技术解析构象异质性；最后通过原子模型构建与比对，揭示结构变化与脂质相互作用的分子细节。
低pH诱导Cx46/50的门控状态
在酸性条件下，Cx46/50通道的N端结构域（N-terminal domain, NT）向孔内位移约18°，同时跨膜螺旋TM2通过保守脯氨酸铰链（P88）发生9°弯曲，使孔道变窄。与中性pH下的稳定开放态（pore直径约11.6 ?）相比，门控态中脂质分子（PL1、PL2）侵入孔内，占据NT原有的疏水锚定位点，形成双层“垫圈”稳定闭合构象。此外，亚基界面处的间隙脂质（interstitial lipid, IL）可能作为脂质进出孔道的通道。
pH门控依赖脂质且可逆
研究通过对比实验明确脂质环境为门控必要条件：在两亲性聚合物中，即使处于低pH条件，通道仍保持开放态且孔内无脂质；而纳米盘中的通道在pH 5.8时呈现门控态，且该过程可逆——当pH恢复至中性时，脂质退出孔道，通道重新开放。这一发现解释了生理环境中pH门控的缓慢可逆性。
保守组氨酸的潜在传感机制
结构分析提示，保守组氨酸H95与IL的磷酸头基距离<3.5 ?，可能在质子化后通过盐桥稳定IL结合；另一保守组氨酸H17位于NT与TM1铰链区，其质子化可能通过相邻的E16电荷补偿维持门控构象。这些发现为组氨酸作为pH传感器提供了结构支持。
低pH诱导多状态构象集合
3DVA分析显示，酸性条件下通道存在三种状态：脂质介导的门控态（43.2%）、稳定开放态（18.2%）和去稳定开放态（38.5%）。后者NT轻微位移，TM2弯曲约6.4°，形成9.7 ?的狭窄孔隙但仍允许离子通过。中性pH下虽以开放态为主（87%），但通过深度分类仍检测到少量门控态（2.4%），表明门控态在生理条件下可能短暂存在。
NT门控呈非协同性
亚基水平分析显示，低pH条件下67%的亚基呈门控态，但完全门控的间隙连接罕见（1.7%）。门控亚基数量服从玻尔兹曼分布，且构象排列无协同性，支持“单个亚基门控可能足以触发通道关闭”的功能学观点。
本研究通过高分辨率结构生物学手段，揭示了脂质在connexin通道pH门控中的核心作用：酸性环境驱动脂质从膜环境渗透至孔内，通过置换NT引发构象变化，进而可逆地关闭通道。这一机制不仅解释了细胞在应激状态下快速隔离损伤区域的策略，还为理解白内障（与Cx46/50功能障碍相关）等疾病的分子基础提供了新视角。该研究建立的“脂质-构象耦合”模型可能适用于其他大孔通道（如innexin、pannexin），为靶向间隙连接相关疾病（如心律失常、神经病变）的药物设计提供了结构框架。
