超高效Prime Editing系统在番茄中的开发：实现位点非依赖性精准基因组编辑

《Nature Communications》：Development of an ultra-efficient prime editing system in tomato

本研究针对Prime Editing(PE)技术在双子叶植物中应用存在的效率低、位点依赖性强和遗传性差等挑战，开发了一种超高效Prime Editing(UtPE)系统。研究人员通过整合进化的PE6变体(PE6c/PE6ec)、优化的aepegRNA、RNA分子伴侣NC以及双生病毒复制子递送系统，在番茄中实现了平均16.0%的预期编辑效率，在T0代植株中最高获得87.5%的预期编辑效率，成功实现了多基因编辑和T1代稳定遗传，并获得了无关节花序梗和草甘膦抗性等性状，为双子叶作物精准育种提供了强大工具。

　　

基因组编辑技术正在革命性地改变作物育种方式，其中Prime Editing(PE)技术因其能够在不引起DNA双链断裂且无需供体DNA模板的情况下实现精准基因组编辑而备受关注。然而，该技术在双子叶植物中的应用一直面临效率低下、高度位点依赖性以及可遗传编辑事件稀少等严峻挑战。这些问题严重限制了PE技术在番茄等重要双子叶作物育种中的实际应用。

为了突破这些技术瓶颈，由Tien Van Vu和Ngan Thi Nguyen共同领导的研究团队在《Nature Communications》上发表了他们的最新研究成果。他们成功开发了一套超高效Prime Editing(UtPE)系统，通过多重策略优化显著提升了番茄中的编辑性能。该系统整合了多种先进组件：包括在哺乳动物细胞中表现优异的进化PE6蛋白变体(PE6c和PE6ec)、结构优化的 altered engineered PE guide RNA(aepegRNA)、能够促进逆转录酶 processivity 的RNA分子伴侣NC，以及可增强组件表达的双生病毒复制子递送系统。

研究团队为不同编辑需求设计了特定版本的UtPE系统：UtPEv1(基于PE6c)适用于简单编辑目标(非结构化RTT序列)，而UtPEv3(基于PE6ec-NC)则专门针对复杂编辑目标(结构化RTT或多核苷酸变化)。与基于PE2max的编辑工具相比，UtPE系统将预期编辑效率提高了3.39至8.89倍，在愈伤组织阶段达到平均16.0%的预期编辑效率，并成功在之前无法编辑的位点(如SIHKT1;2、SICENH3和SIDMR6)实现了有效编辑。

在技术方法方面，研究主要通过以下关键实验完成：利用农杆菌介导的转化技术将PE组件递送至番茄子叶外植体；采用靶向深度测序技术精准定量编辑效率；通过Sanger测序和ICE分析工具筛选T₀和T₁代编辑事件；利用双生病毒复制子系统增强组件表达；并系统评估了不同PE6变体及其与NC分子伴侣融合的性能差异。

UtPEv1在番茄中的卓越表现

研究团队首先在SICAB13位点测试了不同PE变体的编辑效率。结果显示，PE6c变体的表现显著优于PE2max和PE6d，平均预期编辑效率达到11.74±1.74%，是PE2max的3.98倍。当研究人员将NC RNA分子伴侣融合至PE6c的C端时，编辑效率进一步提升至16.03±1.34%，该系统被命名为UtPEv2。在六个额外位点的测试中，UtPEv1在所有位点均优于基于PE2max的双子叶PE系统，编辑效率提高幅度为3.39至8.89倍。值得注意的是，在之前完全无编辑活性的SIDMR6位点，UtPEv1也实现了8.09±0.25%的预期编辑效率。

UtPEv3提升复杂RTT结构的编辑效率

针对含有复杂逆转录模板(RTT)结构的SlHKT1;2位点(需要同时引入三个核苷酸变化)，研究团队测试了多种PE6组合变体。结果表明，PE6ec-NC(即UtPEv3)在该位点表现最佳，编辑效率比UtPEv1提高1.37倍。UtPEv3在含有较长或复杂RTT序列的位点(如SlCAB13和SlHKT1;2)表现出最优性能，而在结构相对简单的位点，UtPEv1和UtPEv2则能产生更多不含支架插入等位基因的编辑事件。

UtPE系统的特异性与安全性评估

尽管UtPE变体的活性显著高于PE2max，但脱靶分析显示，在预测的潜在脱靶位点均未检测到明显的PE编辑痕迹，indel突变频率也仅处于背景水平，表明编辑效率的提升并未以牺牲特异性为代价。

多基因编辑能力验证

研究证实UtPE系统能够高效实现多基因同步编辑。UtPEv1和UtPEv3在同时编辑两个(SIOR和SICAB13)和三个(SIOR、SICAB13和SIPRD)靶点时，表现出与单基因编辑相当的效率，其中UtPEv3在三基因编辑中略优于UtPEv1。

可遗传编辑与表型验证

在T₀代转化植株中，UtPE工具在所有测试位点均成功获得了携带预期编辑的事件，其中5/8的位点产生了纯合预期编辑事件。预期编辑效率在2.9%至87.5%之间，显著高于PE2max和PE2max-NC。重要的是，这些编辑能够稳定遗传至T₁代，并产生可观察的表型变化：携带纯合SlMBP21敲除等位基因的T₁植株表现出无关节表型；而携带纯合SlEPSPS1(TIPS)等位基因的植株则表现出对5mM草甘膦的抗性。尽管SICENH3(del)和SICENH3(sub)等位基因的初步杂交实验未能产生真正的单倍体后代，但UtPE系统精准引入这些修饰的能力为研究着丝粒生物学和开发单倍体诱导技术奠定了基础。

该研究开发的UtPE系统代表了双子叶植物Prime Editing技术的重要突破。其高效率、位点非依赖性和良好的遗传稳定性为精准作物育种提供了强大平台，有望在基础基因功能研究和作物性状改良中发挥重要作用。未来，将该系统与无组织培养递送方法结合，将进一步扩大其在精准植物育种中的应用前景。