靶向SPAK激酶抑制肝细胞癌进展并逆转免疫耗竭微环境

《Nature Communications》：Targeting SPAK suppresses progression and averts an immune exhaustive microenvironment in hepatocellular carcinoma

这项研究针对肝细胞癌（HCC）中免疫检查点抑制剂疗效差异大、免疫耗竭微环境形成机制不明的临床难题，通过激酶组筛选发现SPAK是HCC免疫耗竭相关关键激酶。研究团队综合运用生物信息学分析、临床队列数据、基因编辑小鼠模型和细胞实验，揭示SPAK通过磷酸化GSK3βSer9稳定c-Jun和PD-L1蛋白，促进肿瘤干细胞特性、多激酶抑制剂耐药及CD8+T细胞耗竭。尤为重要的是，SPAK抑制剂ZT-1a与PD-1阻断剂联用显著增强抗肿瘤疗效，为SPAK高表达HCC患者提供了新的联合治疗策略。该研究发表于《Nature Communications》，为HCC精准免疫治疗提供了新靶点和生物标志物。

　　

肝细胞癌是全球癌症相关死亡的第三大原因，其中约90%的病例为肝细胞癌。近年来，免疫治疗尤其是抗PD-1/PD-L1疗法，虽然给晚期肝细胞癌患者带来了希望，但患者对这类疗法的反应存在显著差异。这背后的关键问题在于肿瘤免疫微环境的异质性，特别是免疫耗竭亚型，其特征是T细胞功能严重失调、细胞毒性活性受损和预后不良。因此，深入探究肝细胞癌免疫耗竭的分子机制，并寻找可预测生物标志物和有效的联合治疗策略，成为当前研究的迫切需求。

蛋白激酶在肝细胞癌进展和免疫逃逸中扮演着重要角色，但人类基因组编码的514种蛋白激酶中，大多数在肝细胞癌中的作用尚不明确。为了解决上述问题，研究人员在《Nature Communications》上发表了最新研究成果。

为开展此项研究，作者团队整合了多组学数据分析（包括TCGA、ICGC等公共数据库的转录组、蛋白质组、甲基化组数据）、临床队列研究（多个同济医院队列的样本）、基因工程小鼠模型（如DEN/CCl₄诱导肝癌、Sleeping Beauty转座子系统介导的AKT/NRasV12或MYC/sgP53肝癌模型）、细胞功能实验（细胞增殖、克隆形成、球体形成等）、分子互作及信号通路研究（免疫共沉淀、体外激酶实验、蛋白质稳定性检测、质谱分析等）、免疫学分析（多色流式细胞术、多重免疫荧光、T细胞共培养杀伤实验）以及药物干预研究（SPAK抑制剂ZT-1a与抗PD-1抗体联合治疗小鼠模型）。

高SPAK表达与肝细胞癌不良预后及免疫耗竭相关

通过对肝细胞癌激酶组进行分析，研究人员发现STE20/SPS1相关脯氨酸/丙氨酸丰富激酶（SPAK）在肿瘤组织中高表达，且其表达量与T细胞耗竭评分呈最强正相关。临床队列分析显示，SPAK在肝细胞癌组织中的mRNA和蛋白水平均显著高于癌旁组织，其高表达与肿瘤组织学分级差、侵袭性亚型（如Hoshida S2、TCGA-iCluster1）以及患者总生存期和无病生存期缩短显著相关。单细胞RNA测序和空间转录组分析进一步表明，癌细胞是肝细胞癌中SPAK表达的主要来源。这些结果提示SPAK高表达与肝细胞癌的侵袭性表型、不良预后及免疫耗竭肿瘤微环境密切相关。

SPAK促进肝细胞癌的肿瘤发生、干细胞特性及多激酶抑制剂耐药

功能实验证实，肝细胞特异性敲除SPAK能显著抑制化学致癌剂DEN/CCl₄或癌基因（myr-AKT/N-RasV12, MYC/sgP53）诱导的小鼠肝癌发生。体外和体内实验均表明SPAK能增强肝细胞癌细胞的增殖能力。值得注意的是，SPAK表达与癌症干细胞标志物（如EpCAM, PROM1/CD133, SOX9）正相关，而与成熟肝细胞标志物负相关。SPAK过表达能增强癌细胞的球体形成能力和肿瘤起始能力，反之其敲低则抑制这些特性。此外，SPAK过表达导致肝细胞癌细胞对索拉非尼、仑伐替尼和多纳非尼等一线多激酶抑制剂产生耐药，而SPAK敲低则恢复其敏感性。在多个耐药细胞系、异种移植瘤和组织类器官的数据集中，SPAK mRNA水平在76%的耐药组中显著升高。

SPAK促进细胞毒性T细胞耗竭并抑制其杀伤功能

在免疫缺陷小鼠和免疫健全小鼠的移植瘤模型中，SPAK过表达在免疫健全小鼠中促肿瘤作用更强，提示其涉及免疫调节。单细胞RNA测序分析显示，SPAK高表达的肝细胞癌中，效应样CD8⁺T细胞减少而耗竭样CD8⁺T细胞增多。流式细胞术和多重免疫荧光分析小鼠肝癌模型肿瘤组织发现，SPAK敲低可增加颗粒酶B⁺干扰素-γ⁺的细胞毒性CD8⁺T细胞，减少PD-1⁺TIM-3⁺的耗竭CD8⁺T细胞；SPAK过表达则产生相反效应，而激酶失活突变体（S371A）可逆转此效应。在T细胞与肝癌细胞共培养体系中，SPAK过表达的肝癌细胞更能抵抗T细胞介导的杀伤，并诱导共培养的CD8⁺T细胞表达更高水平的耗竭标志物和更低水平的细胞毒性分子。

SPAK通过使GSK3β失活并稳定c-Jun促进肝细胞癌进展和耐药

磷酸化激酶芯片筛选发现，SPAK过表达后，GSK3β在丝氨酸9位点的磷酸化（p-GSK3β^Ser9）以及c-Jun在丝氨酸63位点的磷酸化（p-c-Jun^Ser63）水平显著升高。机制研究表明，SPAK直接与GSK3β结合并磷酸化其Ser9位点，此过程不依赖于AKT1。磷酸化的GSK3β（p-GSK3β^Ser9）活性被抑制，进而减少了其对c-Jun的Ser243位点磷酸化（此磷酸化可促进c-Jun经泛素化降解）。因此，SPAK通过抑制GSK3β活性，阻碍了E3泛素连接酶FBXW7对c-Jun的泛素化降解，从而稳定了c-Jun蛋白。c-Jun抑制剂T-5224可逆转SPAK诱导的肿瘤形成、干细胞特性增强及耐药表型。

SPAK通过稳定PD-L1促进肝细胞癌免疫耗竭

研究发现SPAK同样通过GSK3β通路调控PD-L1的稳定性。SPAK高表达的肝细胞癌组织中PD-L1蛋白水平也较高。SPAK过表达可上调PD-L1蛋白水平（但不显著影响其mRNA），此效应可被SPAK抑制剂ZT-1a或S371A突变体取消。机制上，SPAK通过磷酸化并抑制GSK3β，干扰了GSK3β介导的PD-L1与E3泛素连接酶β-TrCP的结合，从而抑制了PD-L1的泛素化降解，增强了其蛋白稳定性。在体内实验中，使用PD-L1阻断抗体可以逆转SPAK过表达导致的CD8⁺T细胞耗竭增加和抗肿瘤免疫功能抑制。

SPAK基因体内高甲基化导致其在肝细胞癌中高表达

对肝细胞癌甲基化组数据的分析发现，SPAK基因体内（gene body）CpG位点的甲基化水平显著高于其启动子区，且基因体甲基化水平与SPAK表达呈正相关。DNA甲基转移酶抑制剂5-氮杂-2'-脱氧胞苷（5-aza-dC）处理可降低肝细胞癌细胞中SPAK的表达。进一步研究表明，DNMT3B（而非DNMT1或DNMT3A）是介导SPAK基因体高甲基化和转录激活的关键分子。染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）和CUT&Tag分析证实DNMT3B和组蛋白标记H3K36me3富集于SPAK基因体区域。

联合靶向SPAK和PD-1在肝细胞癌中显示出增强疗效

对接受免疫检查点抑制剂治疗的肝细胞癌患者样本分析发现，应答者肿瘤组织中SPAK表达更高。在多种 preclinical 肝细胞癌小鼠模型（DEN诱导、 hydrodynamic 注射AKT/NRasV12诱导、原位移植Hepa1-6细胞）中，SPAK激酶抑制剂ZT-1a与抗PD-1抗体联合治疗，相比单药治疗，能更显著地抑制肿瘤生长，并改善肿瘤微环境中的T细胞功能。

本研究系统阐明了SPAK在驱动肝细胞癌进展、干细胞特性、多激酶抑制剂耐药以及免疫耗竭微环境形成中的关键作用。其分子机制核心在于SPAK直接磷酸化GSK3β^Ser9，进而稳定致癌转录因子c-Jun和免疫检查点蛋白PD-L1。研究还揭示了DNMT3B依赖的SPAK基因体高甲基化是其表达上调的重要机制。最重要的是，研究发现靶向SPAK激酶活性（使用抑制剂ZT-1a）与PD-1阻断疗法联合，在 preclinical 模型中展现出协同抗肿瘤效果。这些发现不仅深化了对肝细胞癌免疫调控机制的理解，更重要的是为SPAK高表达的肝细胞癌患者提供了新的生物标志物和极具潜力的联合治疗策略（SPAK抑制剂联合免疫检查点阻断），有望克服当前部分肝细胞癌患者对现有疗法不响应的难题，推动肝细胞癌的精准免疫治疗发展。