《Nature Communications》：Temporal constraints on enhancer usage shape the regulation of limb gene transcription
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本研究针对发育过程中增强子使用的时序特异性如何调控基因表达这一核心问题，以小鼠肢体发育为模型，聚焦Shox2基因。研究人员创新性地构建了双色报告系统，结合单细胞多组学、三维基因组学和功能缺失实验，揭示了早期、共同和晚期增强子分别负责转录的起始、维持和终止，并发现Hoxd13可驱动增强子-启动子接触解离进而导致基因沉默。该工作为理解复杂表达模式的形成提供了动态调控新范式。
在生命 orchestration）中扮演着核心角色，它们通过结合特定的转录因子来远程调控基因的时空特异性表达。然而，相较于对增强子空间特异性的深入理解，科学界对单个增强子如何随时间推移协调其活性，以精确控制发育过程中基因表达的起始、维持乃至终止（即“调控轨迹”， regulatory trajectory）仍知之甚少。肢体发育作为一个经典的模型系统，其复杂的形态发生和明确的基因表达模式，为研究此类动态调控过程提供了理想场所。小鼠肢体芽在胚胎期9.5天（E9.5）从前侧板中胚层开始萌发，最初由未分化的间充质细胞组成，具备形成所有近远轴（proximodistal）节段的潜力。随着发育进行，细胞逐渐确定其位置身份，形成近端节段（如上臂、前臂）的能力减弱，而表达远端因子（如Hoxd13）的细胞则走向指骨等结构的形成。在这一过程中，许多关键基因的表达模式会发生动态变化，例如Shox2基因，其表达始于早期肢芽（E9.5/E10.0），随后维持在心房、近端结缔组织和软骨中，但在手板（handplate）区域被抑制，对肱骨和股骨等近端骨骼的生长至关重要。理解其表达如何被精确调控，是揭示肢体模式形成机制的关键。
为了深入解析Shox2基因在肢体发育过程中的动态调控机制，来自瑞士日内瓦大学遗传医学与发展系及日内瓦大学遗传学与基因组学研究所（iGE3）的Raquel Rouco、Guillaume Andrey等研究人员在《Nature Communications》上发表了他们的最新研究成果。他们旨在阐明是否存在不同的调控元件分别控制基因表达的起始（initiation）和后续的维持（maintenance），并揭示导致调控终止（decommissioning）和基因抑制的分子过程。
研究人员首先通过重新分析公共数据库中的肢芽转录组和表观基因组数据，发现在90个与肢体发育相关的基因座中，其潜在的增强子 repertoire 会随时间发生显著变化。这些增强子可分为早期作用（early-acting）、共同作用（common-acting）和晚期作用（late-acting）三类，并且大多数基因座（84%）同时包含这三类增强子，提示增强子使用的时序转换是肢体发育基因调控的普遍特征。以Shox2基因座为例，其所在的1.1 Mb拓扑关联结构域（TAD, Topologically Associating Domain）内，就鉴定出13个早期、2个共同和4个晚期假定的增强子。
为了精确追踪Shox2基因的调控轨迹并分选处于不同调控阶段的细胞，研究团队巧妙地设计并构建了一个双色转基因报告系统（Shox2trac）。该系统通过在Shox2基因起始密码子上游1 kb处插入一个包含不稳定mCherry（dmCherry）报告基因、P2A肽序列和CRE重组酶基因的传感器盒，同时在Rosa26安全港位点整合一个由loxP-STOP-loxP（floxed）序列控制的EYFP报告基因。当Shox2转录时，会同时表达dmCherry和CRE；CRE酶会切除STOP序列，导致EYFP的持续表达，即使Shox2后续沉默，EYFP信号仍能保留。因此，dmCherry+EYFP-细胞代表转录起始（initiating）细胞，dmCherry+EYFP+细胞代表转录维持（maintaining）细胞，而dmCherry-EYFP+细胞则代表经历过转录但现已沉默的“退役”（decommissioned）细胞。利用此系统，他们通过四倍体互补法获得了报告小鼠胚胎，并证实该系统能准确重现Shox2的内源表达模式。有趣的是，他们在E12.5及以后的肢体远端（如第4、5指）观察到了仅表达EYFP而不表达dmCherry的细胞群体，这提示这些远端区域的细胞起源于早期曾表达Shox2但随后其表达被关闭的祖细胞。
通过对Shox2trac小鼠E10.5至E13.5的后肢细胞进行单细胞RNA测序（scRNA-seq），研究人员深入刻画了肢体间充质细胞的异质性，并成功鉴定出15个细胞簇，从肢体祖细胞（limb progenitors）到分化的近端和远端细胞群体。RNA速率（RNA velocity）分析预测了细胞从祖细胞状态向近端和远端谱系分化的轨迹。通过分析不同细胞簇中Shox2、dmCherry-CRE和EYFP的表达，他们将细胞划分为起始、维持、退役和静止（inactive）四种状态。结果显示，起始细胞主要富集在早期祖细胞簇；维持细胞位于表达Shox2的近端细胞簇；而退役细胞则同时存在于近端和远端细胞簇中，这证实了远端肢体细胞确实有部分来源于早期表达Shox2的祖细胞。随着发育进行，起始细胞比例下降，而维持和退役细胞比例增加，表明Shox2的表达在近端细胞中得以维持，而在贡献远端结构的细胞中被逐渐关闭。
利用荧光激活细胞分选（FACS）技术，研究人员从E10.5到E14.5的Shox2trac肢体中分离了静止（EYFP-dmCherry-）、维持（EYFP+dmCherry+）和退役（EYFP+dmCherry-）细胞群体，并通过批量RNA-seq验证了各群体的分子特征。静止细胞表达远端标志物（如Hoxd13）和非间充质标志物；维持细胞高表达Shox2及近端标志物（如Hoxa11），并分化为软骨和结缔组织；退役细胞则表达较低的Shox2，但保留间充质身份，并同时表达近端和远端标志物。定量分析显示，在发育早期，前肢中维持细胞比例高于后肢，反映了前后肢发育的时序差异。随着时间的推移，静止细胞比例下降，维持细胞比例先增后减，而退役细胞比例逐渐上升，动态地描绘了Shox2转录活动的变化趋势。
为了揭示不同时序性增强子 repertoire 的染色质基础，研究团队在分选出的维持细胞中进行了H3K27ac（活跃增强子标记）的ChIP-seq分析。他们在Shox2的TAD内鉴定出34个假定的增强子，并根据其H3K27ac信号的时间动态将其分为26个早期、4个共同和4个晚期增强子。这些增强子的活性在前后肢中呈现高度相似的时序限制性。已有体内报告基因实验验证了其中部分增强子的阶段性活性，支持了此分类的可靠性。这表明，Shox2的转录维持需要大量早期增强子在发育早期启动表达，而后期则可能由较少但持续活跃的共同增强子和晚期增强子来维持。
三维基因组结构分析（Capture Hi-C, C-HiC）显示，Shox2基因座的染色质构象与其增强子活性紧密相关。与胚胎干细胞中相对松散的结构相比，在肢体发育的静止细胞中，即可观察到TAD边界互作增强以及Shox2启动子与少数早期增强子之间特异的接触增加。当基因座转变为活跃状态（维持细胞）时，整个TAD内的互作普遍增强，并呈现出更明显的亚TAD（subTAD） segregation，将Shox2和其邻近基因Rsrc1的调控区域分隔开。尽管不同发育阶段维持细胞的C-HiC图谱总体相似，但仍能观察到细微但一致的互作变化：一个早期增强子在E13.5时与Shox2的互作减弱，而两个晚期增强子的互作则增强，这反映了增强子 repertoire 从早期向晚期的时序性转换。
为了功能上验证不同类型增强子的作用，研究人员构建了两种增强子缺失突变体。其一为Shox2Δearly，缺失了7个早期增强子。该突变在E11.5导致肢体范围内dmCherry和EYFP信号减弱，以及远端肢体EYFP信号的缺失。流式细胞术和RNA-seq分析证实，突变胚胎中E10.5的维持细胞几乎完全缺失，Shox2表达显著下降，但到E14.5时，近端区域的表达得以部分恢复，而远端区域的表达缺失持续存在。这表明早期增强子对于转录的起始至关重要，但其缺失后可被剩余增强子部分补偿。其二为Shox2Δlate，缺失了2个晚期和2个共同增强子。该突变在早期（E11.5）无明显表型，但在E14.5时，肢体中央区域的dmCherry信号特异性减弱，维持细胞比例下降，而退役细胞比例增加，Shox2表达仅在晚期降低。这表明晚期/共同增强子主要作用于转录的维持阶段，其缺失会导致基因的提前沉默（即过早退役）。
对退役细胞的深入分析发现，其Shox2基因座的三维结构发生了显著变化：增强子-启动子互作大幅减少，两个亚TAD之间的 segregation 减弱，结构类似于静止细胞。同时，Shox2启动子区域的H3K27ac信号显著降低，早期和共同增强子上的H3K27ac覆盖度也普遍下降，尽管有两个晚期增强子在E13.5时仍保持一定的H3K27ac信号。此外，PRC2复合物相关的抑制性标记H3K27me3在退役细胞的Shox2启动子处仅有微弱富集，提示基因沉默主要源于增强子活性的关闭，而非Polycomb介导的压制性染色质环境的建立。
最后，研究探讨了已知的Shox2拮抗因子Hoxd13在调控退役中的作用。他们利用Ulnaless-like（Ulnaless-like, Ull）等位基因，在Shox2表达区域内异位诱导Hoxd13的表达。CUT&RUN实验表明，在Ull突变体的近端肢体中，HOXD13蛋白能够结合到Shox2的多个增强子上，其结合模式与远端肢体中的情况相似。表型分析显示，Ull突变体在E13.5时，维持细胞比例下降，而退役细胞比例增加，肢体中央区域的dmCherry信号减弱，这与晚期增强子缺失的表型类似。这表明Hoxd13的异位表达足以驱动Shox2基因座的提前退役，很可能通过结合并抑制其增强子的活性来实现。
综上所述，这项研究系统地描绘了肢体发育中Shox2基因的动态调控轨迹。它揭示了时序性增强子 repertoires 的存在及其在转录起始、维持和终止中的分工；阐明了染色质三维结构的动态变化与增强子活性转换相耦合；并证实了Hoxd13可通过促进增强子-启动子接触解离来驱动基因座的退役。该工作不仅深化了对肢体模式形成调控机制的理解，更重要的是，它提供了一个研究基因在复杂发育过程中动态表达调控的通用框架，对于理解其他器官发育乃至疾病中基因表达失调的机制具有广泛意义。
研究人员为开展此项研究运用了几个关键的技术方法：利用双色荧光报告系统（Shox2trac）和流式细胞分选（FACS）来追踪和分离处于不同转录状态的细胞群体；通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）刻画了肢体发育的细胞图谱和Shox2的表达动态；采用染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）针对组蛋白修饰（H3K27ac）来鉴定活跃的增强子并分析其时空动态；利用捕获Hi-C（C-HiC）技术解析了Shox2基因座的三维基因组结构及其在调控轨迹中的变化；并运用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建了特定的增强子缺失小鼠模型（Shox2Δearly和 Shox2Δlate）进行功能验证。研究所用小鼠胚胎主要通过四倍体互补法由基因编辑的胚胎干细胞获得。
Characterization of temporal enhancer repertoire changes at limb development-associated loci
通过对E10.5和E13.5小鼠肢体的表观基因组数据再分析，发现肢体发育相关基因的增强子使用存在普遍的时序性转换。大多数基因座同时包含早期、共同和晚期作用的增强子。Shox2基因座是研究增强子repertoire如何随时间控制基因转录的典型范例。
A transgenic reporter system to characterize the Shox2 regulatory trajectory
研究人员开发了双色报告系统Shox2trac，将Shox2的调控轨迹概念化为起始（initiation）、维持（maintenance）和退役（decommissioning）三个阶段。体内成像证实该系统能准确报告Shox2的表达，并发现肢体远端存在仅EYFP阳性的细胞，提示其起源于早期表达Shox2但已沉默的祖细胞。
Single-cell insights into Shox2 transcriptional dynamics trace early decommissioned cells in the distal limb
单细胞RNA测序分析揭示了肢体间充质细胞的异质性及其分化轨迹。通过分析Shox2、dmCherry-CRE和EYFP的表达，将细胞划分为不同调控状态。发现退役细胞不仅存在于近端，也存在于远端细胞簇，证实了远端肢体细胞部分来源于早期表达Shox2的祖细胞。
The dual-color reporter approach allows sorting of inactive, maintaining, and decommissioned cells over time
通过FACS分选和批量RNA-seq，明确了静止、维持和退役细胞群的分子特征。定量分析了各细胞群在发育过程中的比例变化，显示了Shox2转录活动的动态演变：起始细胞减少，维持细胞先增后减，退役细胞逐渐增加。
Shox2 regulatory maintenance is associated with distinct enhancer repertoires acting over time
在维持细胞中进行H3K27ac ChIP-seq，鉴定出Shox2基因座内34个增强子，并按其活性动态分为早期（26个）、共同（4个）和晚期（4个）三类，表明其转录维持需要不同时序增强子 repertoire 的协同作用。
The 3D locus topology of Shox2 mirrors temporal enhancer repertoire shifts
C-HiC分析显示，Shox2基因座的3D结构与增强子活性变化同步。从静止到活跃状态，增强子-启动子互作增强，亚TAD结构形成。在维持阶段，早期增强子互作减弱而晚期增强子互作增强，反映了增强子使用的时序转换。
Shox2 enhancers act in a stage-specific manner to control Shox2 initiation and maintenance
功能缺失实验表明，早期增强子缺失（Shox2Δearly）主要影响转录起始，导致早期维持细胞缺失和Shox2表达下降，但晚期表达可部分恢复。晚期增强子缺失（Shox2Δlate）则特异性影响后期转录维持，导致维持细胞减少和退役细胞增加。
Enhancer-promoter disconnection marks Shox2 decommissioning
对退役细胞的分析表明，其特点是增强子-启动子互作显著减少，H3K27ac信号在启动子和大多数增强子（除两个晚期增强子外）上丢失，且三维结构趋于松散，类似于静止状态。基因沉默主要源于增强子活性的关闭而非H3K27me3介导的压制。
An Ulnaless-like allele triggers ectopic Shox2 locus decommissioning
利用Ulnaless-like（Ull）等位基因使Hoxd13在Shox2表达域异位表达，发现HOXD13能结合Shox2的多个增强子，并导致维持细胞减少和退役细胞增加，表明Hoxd13足以诱导Shox2基因座的提前退役。
本研究揭示了基因表达调控的一个核心层面：时序性增强子 repertoires 如何通过分工协作，动态控制基因的转录轨迹。研究发现，早期增强子主要负责在祖细胞中启动转录，而晚期和共同增强子则负责在分化细胞中维持表达。当细胞命运决定需要关闭基因表达时（如远端肢体形成），特定的转录因子（如Hoxd13）可能通过抑制增强子活性、破坏增强子-启动子空间互作来驱动基因座的“退役”。这种调控模式不仅确保了Shox2在肢体近端结构的持续表达，也使其在远端前体细胞中适时沉默，从而精确塑造了复杂的肢体形态。该工作所建立的“调控轨迹”研究框架和多重技术方法，为在多种生物学过程中解析基因的动态表达调控提供了范本。
