《Nature Communications》：RAS/MEK/PI3K pathway inhibition augments response to CD40 agonism by targeting CD11b+ Bregs thereby overcoming melanoma PD1-resistance
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本研究针对免疫检查点抑制剂(ICB)耐药的BRAFwtNRASwt或BRAFwtNRASmut黑色素瘤患者，开发了RAS/MEK/PI3K通路抑制剂(rigosertib和trametinib)联合CD40激动剂(aCD40)的二线治疗方案。研究发现该组合疗法通过选择性抑制CD11b+PD-L1+调节性B细胞(Bregs)，促进CD8+T细胞活性，在临床前模型中实现近95%的肿瘤消退，为ICB耐药患者提供了新的治疗选择。
免疫检查点抑制剂(ICB)革命性地改变了晚期黑色素瘤的治疗格局，然而约40-55%的患者对PD1抑制剂原发性耐药，25-30%的初始应答者会出现获得性耐药。对于BRAF野生型/NRAS野生型或NRAS突变型黑色素瘤患者，一旦发生ICB耐药，后续治疗选择极为有限。CD40作为肿瘤坏死因子受体超家族成员，其激动剂(aCD40)能够激活树突状细胞和B细胞，理论上可增强抗肿瘤免疫应答。但临床研究显示，aCD40联合aPD1治疗ICB耐药黑色素瘤的客观缓解率仅为15%，这提示存在未知的抵抗机制。
范德比尔特大学研究团队在《Nature Communications》上发表的研究揭示，aCD40治疗会诱导免疫抑制性的CD11b+调节性B细胞(Bregs)在肿瘤微环境中扩增，这些细胞通过表达PD-L1和分泌IL-10等机制抑制CD8+T细胞的杀伤功能。有趣的是，研究人员此前发现抑制RAS/RAF/PI3K通路能够上调黑色素瘤细胞CD40表达，增强对ICB的敏感性。这一发现为联合靶向治疗与免疫治疗提供了理论依据。
为了突破这一治疗瓶颈，研究人员采用了多种关键技术方法：通过流式细胞术分析肿瘤免疫细胞浸润；利用单细胞RNA测序(scRNA-Seq)解析患者肿瘤微环境中的细胞亚群；建立患者来源类器官(PDO)模型进行药物筛选；采用T细胞受体(TCR)测序评估T细胞克隆性扩增；并通过蛋白质芯片分析细胞因子分泌谱。研究队列包括31例黑色素瘤患者的肿瘤样本和98个小鼠肿瘤模型。
CD40激动剂在黑色素瘤中诱导CD11b+调节性B细胞
研究人员首先在ICB耐药的患者转移性黑色素瘤组织中发现CD11b+CD20+Bregs的存在。scRNA-Seq数据分析显示，约12%的肿瘤浸润B细胞为CD11b+Bregs，且其频率在aPD1治疗前后无显著变化。机制上，CD11b+Bregs组成性高表达CD40，在aCD40刺激下CD40表达进一步上调，使其对CD40激动更敏感。在ICB耐药的NRAS突变1014黑色素瘤小鼠模型中，aCD40单药治疗虽能抑制82.9%的肿瘤生长，但同时诱导CD11b+CD19+Bregs在肿瘤微环境中从60%扩增至80%。
RAS/MEK/PI3K通路抑制剂逆转ICB耐药
研究人员发现RAS/PI3K/AKT通路抑制剂rigosertib(RGS)联合MEK1/2抑制剂trametinib(T)能协同抑制NRAS突变黑色素瘤细胞系的PI3K/AKT和MEK/ERK通路活性。这一组合治疗将CD40阴性黑色素瘤细胞转化为CD40阳性细胞的比例提高3.5倍。在体内实验中，RGS+T联合aPD1治疗使44%(4/9)的ICB耐药NRAS突变黑色素瘤达到完全缓解(CR)，中位无耐药生存期延长至27天(对照组为6天)。免疫分析显示，联合治疗显著增加肿瘤内CD8+T细胞频率(从0%至20%)和活化程度(从0%至60%)，同时降低M2型巨噬细胞比例。
RAS/MEK/PI3K抑制选择性靶向aCD40诱导的CD11b+Bregs
研究发现RGS能选择性抑制aCD40诱导的CD11b+IL-10产生性B细胞的增殖，而不影响LPS诱导的B细胞活化。当低剂量aCD40(30μg/只)与RGS+T联合使用时，在aPD1预处理的ICB耐药黑色素瘤模型中实现近95%的肿瘤消退，且无显著毒性。机制上，RGS+T有效抑制aCD40诱导的CD11b+Bregs(从10%降至2%)，同时促进CD8+T细胞频率(从25%升至45%)和活化(从20%升至25%)以及M1型巨噬细胞比例(从8%升至16%)的增加。
CD40过表达克服aPD1耐药
通过CRISPR/dCas9技术在黑色素瘤细胞中过表达CD40(CD40-OE)，研究人员发现CD40-OE肿瘤对aPD1治疗更敏感。当CD40-OE肿瘤接受aCD40+aPD1联合治疗时，肿瘤生长被完全抑制。值得注意的是，在CD40-OE肿瘤中，RGS治疗的抑瘤效果减弱，提示RGS的作用部分依赖于诱导CD40表达。TCR测序分析显示，治疗应答肿瘤中存在多克隆T细胞扩增，而非寡克隆扩增，表明联合治疗能激发广泛的抗肿瘤免疫应答。
临床前与临床转化价值
在患者来源类器官(PDO)模型中，RGS+aCD40+aPD1三联疗法能有效抑制aPD1耐药黑色素瘤的生长。研究人员还鉴定出CD11b+PD-L1+Bregs的4基因特征标记(ITGAM、CD274、TNFRSF13B和AHNAK)，该标记在胶质母细胞瘤、低级别胶质瘤等多种癌症中与患者不良预后相关。
研究结论表明，广谱RAS通路抑制剂联合低剂量CD40激动剂能通过双重机制发挥抗肿瘤效果：一方面直接诱导黑色素瘤细胞免疫原性死亡，另一方面选择性抑制免疫抑制性CD11b+Bregs，从而解除对CD8+T细胞的抑制。这种联合策略为ICB耐药的BRAFwtNRASwt和BRAFwtNRASmut黑色素瘤患者提供了有效的二线治疗选择，目前相关二期临床试验(NCT05764395)正在进行中。
该研究的创新性在于首次阐明CD40激动剂治疗诱导免疫抑制性B细胞的机制，并提出通过靶向RAS通路解决这一限制性的策略。研究不仅为黑色素瘤治疗提供新方案，也为理解B细胞在肿瘤免疫调节中的双重作用提供了重要见解。
