《Signal Transduction and Targeted Therapy》：Double-strand break-free epigenetic programming: a safer path for T-cell therapies
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本刊推荐：为解决基于核酸酶的T细胞疗法存在双链断裂（DSB）安全风险这一长期难题，Goudy等开展了基于全RNA CRISPRoff/CRISPRon平台的表观遗传编程研究。该研究在原发性人类T细胞中实现了多位点基因的持久可逆调控，显著改善体内肿瘤控制，为下一代T细胞工程提供了低毒性、可扩展的新路径。
在细胞治疗迅猛发展的今天，基于CRISPR的基因编辑技术为肿瘤免疫治疗带来了革命性突破。然而，传统的核酸酶编辑技术依赖于引入DNA双链断裂（DSB），这会激活p53介导的应激反应，导致细胞毒性、基因组不稳定等安全风险。特别是在多重基因编辑时，同时产生多个DSB会严重损害T细胞的适应性和功能，限制了治疗产品的安全性和有效性。如何在不牺牲编辑效率的前提下提高治疗安全性，成为领域内亟待解决的关键科学问题。
表观遗传编辑技术的出现为这一困境提供了新的解决思路。与传统基因编辑不同，表观遗传编辑器通过催化失活的Cas9（dCas9）与表观修饰结构域融合，在不切割DNA的情况下靶向特定基因座并建立可逆的染色质状态变化。这种"编程而不切割"的策略既能实现持久性的基因表达调控，又避免了DSB相关的风险，为下一代细胞治疗开辟了更安全的路径。
在最近发表于《Nature Biotechnology》的研究中，Goudy团队开发了一种全RNA的CRISPRoff/CRISPRon平台，能够在原发性人类T细胞中进行内源性基因编程而不引入双链断裂。该研究展示了跨多个靶点的持久位点特异性基因沉默或激活，改善的体内肿瘤控制，以及可扩展、低毒性的下一代T细胞工程路径。
关键技术方法
研究采用瞬时电转递送dCas9-CRISPRoff/CRISPRon mRNA与序列特异性sgRNA至原发性人类T细胞。通过多重CRISPRoff建立抑制性染色质状态沉默功能靶点（RASA2）、基准耐久性基因座（CD151）和非CpG岛检查点基因（如PDCD1/PD-1）。同时利用CRISPRon通过靶向增强子去甲基化实现持久基因激活（如通过TSDR去甲基化激活FOXP3）。平台的可调性通过选择sgRNA、数量和剂量来实现，并与正交核酸酶（如Cas12a）介导的TRAC位点敲入相结合。
研究结果
表观遗传编程的机制优势
该平台的核心科学原理直接明了：DSB会激活人类细胞中p53介导的应激反应，而表观遗传编辑器通过结合而不切割的方式避免这些风险，建立可逆的染色质状态而非永久性序列改变。这种设计具有两大优势：首先是持久性与可逆性并存——沉默效果能够持续存在于增殖和重复刺激过程中， yet 在需要时可以解除。表观遗传记忆已从假说转变为实际能力：CRISPRoff驱动的沉默能够持续多个细胞分裂周期、重复抗原刺激，甚至体内转移后仍然保持；CRISPRon可在需要时重新激活基因座。
从功能角度，这些发现支持以下设计：在扩增和早期肿瘤接触阶段破坏T细胞耗竭通路，然后在后期恢复以减轻长期风险；或者以可控方式稳定谱系定义程序，如通过FOXP3 TSDR（Treg特异性去甲基化区域）去甲基化诱导的Treg样表型。这种可调性超越了简单的开/关控制，实现了剂量依赖性和引导RNA数量依赖性的表达水平。
可扩展的多重编辑能力
第二个优势是规模可扩展性：由于避免了同时产生DSB带来的毒性，可以递送多个引导RNA来协调复杂表型。在并排比较中，多重表观遗传沉默实现了高效率且细胞损失最小，而三重-五重核酸酶敲除对T细胞适应性有害。由于底层序列保持完整，表达可以通过引导RNA数量和剂量进行分级调节，模拟自然基因调控而非强制执行静态敲除。这为临床医生提供了调光开关，而不仅仅是开/关的刀片。
超越CpG岛限制的靶向能力
需要摒弃CRISPRoff仅作用于CpG岛启动子的误区。CpG岛确实具有反应性，但它们并不定义可寻址的基因组。研究证明，在许多非岛屿基因处也实现了持久抑制；性能具有基因特异性，但可通过引导RNA池化和剂量进行调节。例如，在数周内实现对抑制性受体和检查点基因的稳健沉默，在更难处理的基因座产生部分但可调节的效果，扩大了可靶向空间超越经典岛屿启动子。
正交性组合策略
另一个优点是正交性。单个合理的敲入——比如将CAR（嵌合抗原受体）插入TRAC（T细胞受体α恒定区）——可以与表观遗传编程分层组合。如本研究所示，TRAC敲入（使用AsCas12a）与CRISPRoff介导的RASA2沉默相结合，提高了体内肿瘤控制而不损失敲入效率；转移后持续的CD151抑制证明了表观遗传记忆。这种"两者兼顾"的模式在同一生产批次中保持高效力并控制结构变异风险。
GMP合规的生产路径
在实践中，在制造过程中应用这些编辑原则需要可扩展的工艺。mRNA电穿孔符合标准GMP（良好生产规范），避免整合并最小化编辑器持久性。在先前显示RASA2缺失增强CAR-T细胞持久性和效应功能的工作中，TRAC-KI CAR-T细胞中CRISPRoff介导的RASA2沉默改善了体内控制和存活，而CD151沉默在转移后保持完整，表明通过增殖具有持久的表观遗传记忆。实用的策略很直接：保留罕见的DNA切割用于添加新受体或安全携带有效载荷；其余部分用可编程染色质完成。
从永久编辑到可逆编程的风险重新定义
从永久编辑转向可逆编程并不会消除风险，而是重新定义风险。监管准备度取决于几个相互关联的领域：表观遗传特异性、基因组稳定性、对编辑器的免疫识别以及对记忆持久性的控制。表观遗传脱靶效应仍然是一个关注点，因为dCas9融合蛋白可能在非预期基因座引入标记；ChIP-seq（染色质免疫沉淀测序）或CUT&RUN结合位点解析亚硫酸氢盐或氧化亚硫酸氢盐测序可以证明靶向参与和甲基化特异性，而长读长平台如Oxford Nanopore或PacBio可以纳入批次放行检测板以检测与敲入相关的易位和大结构变异。同时，应对编辑器及其RNA的先天性和适应性免疫反应进行表征，并报告蛋白质持久性与其效果持久性的关系，可诱导或可擦除模块——如药物响应的dCas9-TET1构建体——在不再需要持久编程时提供可逆安全机制。
研究结论与意义
基于CRISPR的细胞疗法已达到关键监管里程碑。CASGEVY（exagamglobene autotemcel；exa-cel）已获FDA批准用于≥12岁有复发性血管闭塞危象的镰状细胞病（2023年12月8日）和输血依赖性β地中海贫血（2024年1月16日）。在美国，药品和保健品监管局（MHRA）于2023年11月授权CASGEVY，国家健康与护理卓越研究所（NICE）发布了管理准入技术评估——TA1003用于TDT（2024年9月11日）和TA1044用于SCD（2025年2月26日）——支持NHS采用。这些批准基于关键的exa-cel试验，CLIMB SCD-121（NCT03745287）和CLIMB THAL-111（NCT03655678），结果发表于《新英格兰医学杂志》（2023）。CRISPR编辑的T细胞项目继续推进：CTX112正在招募B细胞恶性肿瘤（NCT05643742）和自身免疫适应症（NCT06925542）患者；CB-010仍在ANTLER 1期试验（NCT04637763）中招募，而CTX110（NCT04035434）已终止，参与者处于长期随访中。除T细胞外，《新英格兰医学杂志》发表的一项首次人体研究表明，基因编辑的"低免疫"同种异体β细胞在没有免疫抑制的情况下存活并发挥功能，突显了细胞内在编程如何重塑活药物的风险-获益特征。
表观遗传CRISPR系统为T细胞工程提供了新框架。它们不是进行永久性基因编辑，而是实现可调节的表达状态。如果配以监管就绪的分析方法和深思熟虑的产品设计——谨慎切割、频繁编程——细胞治疗的下一篇章将由刻度盘而非刀片驱动。这项研究发表于《Signal Transduction and Targeted Therapy》，代表了T细胞治疗领域向更安全、更精确调控方向的重要转变，为下一代细胞治疗产品的开发奠定了坚实基础。
