《Cell Stem Cell》：Retinal ganglion cell survival and functional maturation in transiently vascularized human retinal organoids
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本研究针对传统视网膜类器官中视网膜神经节细胞(RGCs)易退化及功能缺失的难题，通过引入干细胞来源的内皮细胞构建瞬时血管样网络，结合微流体装置稳定轴突生长，成功建立了长效功能性人视网膜模型。研究证实血管化类器官(vROs)能显著改善缺氧微环境，促进RGCs存活与功能成熟，并首次记录到感光细胞驱动的ON/OFF/ON-OFF光反应，为视网膜疾病建模和治疗创新提供了突破性工具。
在视觉研究领域，人类视网膜类器官已成为模拟视网膜发育和疾病的强大工具，但其应用仍面临重大挑战。最突出的问题在于类器官内部缺乏血管网络和稳定的轴突投射，导致位于类器官核心的视网膜神经节细胞——负责将视觉信号传递至大脑的“输出神经元”——早期便出现退化甚至死亡，功能严重受限。此外，营养和氧气在类器官内部扩散困难造成的缺氧环境，以及三维悬浮培养导致神经节细胞轴突无法有效向外生长并建立稳定连接，都加剧了细胞凋亡，限制了类器官的长期存活、尺寸增长和功能成熟。这使得大多数研究只能聚焦于类器官中的特定细胞类型（如感光细胞），而非整个组织层面的功能。如何保护视网膜神经节细胞并促进其功能成熟，成为该领域亟待攻克的关键瓶颈。
为了破解这一难题，由Kritika Sharma、Rouhollah Habibey等研究人员领衔的团队在《Cell Stem Cell》上发表了一项创新性研究。他们设计了一种新型生物工程平台，通过将人诱导多能干细胞(hiPSC)来源的内皮细胞(ECs)整合到视网膜类器官(ROs)中，成功诱导形成了瞬时的血管样网络（瞬时血管化视网膜类器官, vROs）；同时，利用微流体装置为视网膜神经节细胞的轴突生长提供了稳定的微环境。研究人员系统性地评估了该策略对类器官结构、细胞存活、缺氧状况以及神经功能的影响。
本研究运用的几个关键技术方法包括：1) 通过ETV2.2转录因子诱导hiPSC分化为内皮细胞，并采用共培养策略（C3方案）将其整合至视网膜类器官中；2) 使用微流体-多电极阵列(MEA)装置进行长期、稳定的细胞外电生理记录，以分析视网膜神经节细胞的自发和诱发活动；3) 利用光遗传学工具（f-ChRimson-EYFP）在视网膜神经节细胞中特异性表达，实现对目标细胞的精准光激活和功能评估；4) 通过单细胞RNA测序(scRNA-seq)和单核RNA测序(snRNA-seq)在转录组水平上全面解析类器官的细胞组成、发育状态和血管化引入的影响；5) 应用缺氧诱导（4% O2，钴氯化物，VEGF）模型来模拟病理性新生血管形成，评估vROs在疾病建模中的应用潜力。
ECs整合入ROs并形成血管样网络
研究人员通过将预分化的内皮细胞与形成中的视网膜类器官共培养（C3方案），成功将PECAM1+的内皮细胞整合到类器官中。这些细胞在类器官内形成了具有管腔样结构、表达COL4A1和CLDN5等血管基底膜和紧密连接蛋白的网络。该整合方案不影响类器官的正常形成效率。
PECAM1+网络随时间发生动态重塑
对vROs的长期观察发现，PECAM1+的血管样结构形态会随时间变化，早期（4-8周）呈管状，后期则呈现放射状形态。其平均长度和面积随培养时间延长而有所减少，表明血管网络处于动态变化中，并非永久稳定。
瞬时血管样网络的功能表征及其对ROs的影响
研究发现，这些血管样结构的管腔能够被动通透荧光右旋糖酐染料，表明其与外部培养基相通。更重要的是，vROs内部的缺氧信号显著低于对照组类器官(ctrl-ROs)，证明血管网络改善了内部氧气和营养供应。这直接导致了vROs的尺寸更大、细胞凋亡（Annexin V+细胞）减少，显示出更好的长期存活能力。
vROs中RGC存活率提高
免疫染色和RT-qPCR分析表明，与ctrl-ROs相比，vROs在12周和18周时表达了视网膜神经节细胞标志物POU4F1和SLC17A6的细胞比例显著更高。特别是在18周时，当ctrl-ROs中的视网膜神经节细胞已大量丢失时，vROs中仍保留了相当数量的视网膜神经节细胞，证明血管化有效促进了视网膜神经节细胞的长期存活。
RGC存活改善并未引起RO发育的全局性改变
单细胞转录组分析证实，在18周时，vROs和ctrl-ROs包含所有主要的视网膜细胞类型，且其整体发育速度（预测的视网膜等效年龄）相当。血管化的引入并未改变类器官的正常发育轨迹。分析还发现了一个在vROs中富集的、与血管化相关的特殊细胞群（vRO-A），其比例与视网膜神经节细胞比例呈正相关。此外，vROs中视网膜神经节细胞的预测成熟度（基于伪时间分析）高于ctrl-ROs，表明其功能也更成熟。
微流体装置中稳定的轴突投射导致功能性RGCs
将类器官与包含微通道的MEA芯片结合培养，使得视网膜神经节细胞的轴突能够稳定长入微通道并覆盖电极。电生理记录显示，vROs来源的视网膜神经节细胞自发电活动频率、神经元同步性（相关性系数）和网络爆发活动均显著高于ctrl-ROs。间隙连接阻断剂卡宾氧酮可降低网络爆发的同步性，说明电突触在此过程中起作用。
RGCs的直接光遗传学激活
通过利用POU4F1启动子驱动视网膜神经节细胞特异性表达光敏感通道蛋白f-ChRimson，研究人员实现了对视网膜神经节细胞的光控激活。vROs的视网膜神经节细胞对光刺激的反应更强、更同步，且具有光反应的细胞比例以及反应保真度均高于ctrl-ROs。
感光细胞驱动的光敏感性揭示ON、OFF和ON-OFF通路
将vROs培养至更晚期（31周），当内源性感光细胞(PRs)充分成熟后，研究人员观察到了由感光细胞介导的、真正的光反应。根据对470nm和580nm光脉冲的反应模式，视网膜神经节细胞可被分为经典的ON型（光开反应）、OFF型（光关反应）和ON-OFF型（对光开和光关均有反应）细胞，表明vROs中已形成了从感光细胞到视网膜神经节细胞的完整垂直信号通路。
缺氧诱导的vROs新生血管形成
将vROs置于低氧(4% O2)环境下培养，可成功诱导PECAM1+血管样网络的增生（新生血管形成），同时血管生成相关基因（PECAM1, vWF）表达上调。这表明vROs可作为研究早产儿视网膜病变(ROP)等血管增生性疾病的模型。
综上所述，本研究通过引入瞬时血管化和微流体轴突导向技术，成功构建了一个能长期存活、功能更为成熟的人视网膜类器官模型。该模型显著改善了视网膜神经节细胞的存活率和功能成熟度，并首次在体外重现了包括ON、OFF、ON-OFF反应在内的视网膜层级电路功能。这一生物工程平台为解决传统视网膜类器官的局限性提供了有效方案，为人类视网膜发育研究、疾病机制探索（如青光眼相关的视网膜神经节细胞退化、早产儿视网膜病变）以及细胞治疗策略的测试开辟了新的道路。尽管血管网络的长期稳定性仍是未来需要优化的挑战，但本研究无疑将视网膜类器官技术推向了一个新的高度，使其在模拟组织复杂性和功能性方面更接近体内真实情况。
