《Cell Genomics》：Differential neuronal survival defines a novel axis of sexual dimorphism in the Drosophila brain
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本研究针对神经系统性二态性形成的细胞和分子机制这一重要科学问题，通过构建高分辨率果蝇中央大脑单细胞转录组图谱，系统解析了doublesex(dsx)和fruitless(fru)基因在性二态神经元中的表达模式。研究发现性差异并非源于大规模转录重编程，而是由发育谱系内选择性修饰介导，并首次揭示"出生顺序"作为性分化的新轴线——雌性偏好神经元早出生而雄性偏好神经元晚出生，该模式通过差异性神经元存活实现。这项发表于Cell Genomics的工作为理解行为多样性的发育基础提供了新框架。
为什么雄果蝇会跳求偶舞而雌果蝇会选择接受或拒绝？这些性别特异性行为背后，是雌雄个体神经系统存在的微妙差异。尽管科学家们早就知道神经系统的性二态性（sexual dimorphism）是行为差异的基础，但对其形成的细胞和分子机制一直了解有限。传统观点认为，雌雄大脑由相同的基本细胞类型组成，性别特异性特征仅通过连接、数量或生理差异产生。然而，这种观点正受到新研究的挑战。
近日发表在《Cell Genomics》上的研究，通过对果蝇中央大脑进行高分辨率单细胞转录组分析，揭示了性二态性形成的新机制。研究人员发现，性差异并非源于大规模转录重编程，而是通过发育谱系内选择性修饰实现，其中"出生顺序"成为性分化的新轴线。
为了深入探究染色体性别如何影响神经系统转录多样性，研究团队构建了包含329,466个中央大脑神经元的单细胞转录组图谱，达到了9.8倍的细胞覆盖深度。通过整合多个公开数据集，他们建立了全面的元中央大脑神经元图谱，定义了246个转录不同的神经元细胞类型。
研究发现，只有约1%的基因在雌雄间存在显著表达差异，且大多数差异幅度有限。引人注目的是，这些差异最显著的神经元群体均表达性决定基因dsx或fru。研究人员分别构建了dsx+和fru+神经元亚图谱，成功解析出不同的转录细胞类型，并通过遗传交叉工具将其与解剖学定义的细胞类型相关联。
研究最关键的发现是揭示了性别与发育出生顺序之间的新关系。在相同的发育谱系（hemilineage）中，雌性偏好神经元通常较早出生，而雄性偏好神经元通常较晚出生。这表明性二态神经元通常是通过区分其转录特征和出生时间的细胞存活发育变化而产生的，而非雌雄对应类型的一对一关系。
对pC1/P1神经元簇的深入分析强化了这一模型。这些神经元是社会唤醒的关键整合中心，在雌雄中均存在但数量和连接性不同。伪时间分析显示，雌性偏好神经元出现在早期发育窗口，而雄性特异性神经元出现在中晚期。在幼虫发育阶段，雌雄DM4背侧谱系神经元数量无差异，但之后通过程序性细胞死亡（PCD）产生了性二态性。
研究还发现了雄性特异性神经肽表达的新机制。Diuretic hormone 31(Dh31)在GABA能神经元群体中呈现高度雄性偏好表达，这种差异依赖于功能性雄性fru异构体（FruM）。抑制细胞死亡可恢复雌性神经元中Dh31的表达，表明这种差异源于雌性特异性PCD而非转录调控。
研究人员通过合并dsx+和fru+亚图谱，构建了统一的性二态神经元图谱，发现在特定发育谱系中，dsx和fru可协同或独立作用以多样化神经元身份。不同谱系间dsx和fru表达的起始和重叠存在显著变异，表明Dsx和Fru协同调控神经元身份和性特异性分化的精确机制具有谱系特异性。
主要技术方法包括：通过10x基因组学平台构建高深度单细胞转录组图谱；利用Harmony算法整合多个数据集；采用SCENIC进行基因调控网络分析；使用Monocle3进行伪时间分析追踪发育轨迹；通过遗传交叉工具（split-Gal4）将转录组身份与解剖学身份相关联；利用免疫荧光和共聚焦显微镜进行蛋白质表达验证。
研究结果一：中央大脑神经元中的性别差异基因表达
分析显示，性决定层级（SDH）基因在雌雄所有神经元细胞类型中普遍表达，而dsx和fru则呈现细胞类型限制性表达。差异表达基因（DEGs）仅占表达基因的约1%，且大多数仅在同一细胞类型中差异表达。X染色体上性别偏好转录本显著富集，支持X染色体作为性别偏好基因表达出现和调控的有利基因组环境。
研究结果二：dsx+神经元细胞类型的独特转录特征
从元图谱中提取并亚聚类dsx+细胞，揭示了雌雄各六个广泛的转录不同神经元亚群。通过结合细胞数量代表和神经递质使用预测其身份，并采用split-Gal4策略遗传交叉dsx表达与细胞类型特异性转录因子，成功标记所有六种dsx+细胞类型。
研究结果三：fru+神经元在性别间的发育分化
fru+中央大脑神经元图谱显示，fru在至少57%的中央大脑谱系中表达。多个fru+神经元细胞类型表现出细胞数量的性别偏好，其中雄性偏好群体对应于中央大脑细胞类型之一。伪时间分析显示，雄性特异性亚型出现在与中晚期神经发生标志物bab1和bab2表达相关的发育窗口。
研究结果四：通过Fru依赖性神经元存活实现雄性特异性神经肽表达
研究发现神经肽Dh31在单个GABA能神经元群体中呈现高度雄性偏好表达。遗传交叉显示这一转录不同的细胞类型对应于CREa1腹侧谱系及其fru+子集mAL神经元。功能实验证明雄性特异性Dh31表达依赖于功能性雄性fru异构体，而抑制细胞死亡可恢复雌性表达。
研究结果五：Dsx和Fru的相互作用定义性二态神经元谱系
统一的dsx+和fru+脑图谱显示，在特定谱系中，存在共表达dsx和fru的神经元亚型，以及独立表达每种转录因子的亚型。伪时间分析揭示了谱系特异性变异，表明Dsx和Fru在神经发生过程中协同调控神经元身份和性特异性分化的机制具有谱系特异性。
研究结果六：发育时序和PCD塑造pC1/P1神经元的性别差异
pC1/P1簇在中央大脑中显示最高数量的性别偏好基因和最显著的细胞数量差异。伪时间分析揭示了先前未发现的发育动力学：雌性偏好时间窗口与早出生神经元标志物相关，而雄性特异性时间窗口与中晚期出生标志物相关。大多数pC1/P1亚型为雄性特异性，表明雌雄pC1/P1神经元来自不同的时间窗口，代表非重叠的神经元亚型。
研究结果七：性二态细胞代表性别间的不同亚群
跨dsx+和fru+群体的差异细胞数量分析显示，雌性偏好神经元类型主要表达早期时间标志物Imp，而雄性偏好类型富集晚期出生标志物dati。这种相关性在整個中央大脑中一致存在，支持性二态神经元通过共享谱系内出生顺序依赖性PCD产生的模型。
这项研究重新定义了神经系统性分化的概念。研究表明，性二态性主要是通过共享发育谱系内不同神经元亚群的选择性存活而产生的，而非构建全新的性别特异性结构。大脑利用保守的空间和时间逻辑，通过细胞存活的选择性调节来调整结果。
研究提出的模型具有重要的进化意义。谱系多样化无需复制，而是单个谱系产生雌雄双方，性别决定哪些神经元存活。这一过程是资源高效的进化解决方案，不仅限于性分化，也适用于物种间的适应性差异。
该研究创建的交互式网站（flycns.com）为更广泛的研究社区提供了可访问的数据资源。随着完整成年大脑连接组的出现，这一转录组图谱将成为连接分子和解剖学身份的重要资源，促进对基因表达和连接性如何共同塑造性别特异性神经回路和行为的更深入理解。
研究局限性包括技术约束与数据集整合可能掩盖了较细微的性别偏好差异。由于成人分析指向二态性的发育起源，未来的性别单细胞发育图谱和体内功能研究将有必要确定性别在中央大脑神经元细胞类型特化中的因果作用。
总之，这项研究通过整合转录组身份、性别和发育历史标志物，提供了对行为多样性如何从共同发育框架产生的新理解。研究表明，性别特异性转录差异通常反映了不同的发育历史，强调了未来单细胞分析需要涵盖广泛发育窗口的必要性。
