利用内源性I-G型CRISPR-Cas系统增强动物乳双歧杆菌的基因组编辑技术

《Applied and Environmental Microbiology》：Enhanced editing of Bifidobacterium lactis using the endogenous Type I-G CRISPR-Cas system

本文开发了一种基于内源性I-G型CRISPR-Cas系统的基因组编辑工具，通过优化质粒骨架（如pBC1-cat）显著提升动物乳双歧杆菌（Bifidobacterium animalissubsp. lactis）的转化效率，并利用同源重组模板实现多轮基因敲除。研究成功敲除糖苷水解酶基因（如Balac 1601 GH36 α-半乳糖苷酶），验证了其对棉子糖代谢的关键作用，为解析益生菌功能基因组和工程化改造提供了实用框架。

　　

CRISPR-Cas系统在动物乳双歧杆菌中的分布与特征

通过对182个动物乳双歧杆菌基因组的分析，发现约95%的菌株携带完整的I-G型CRISPR-Cas系统，而I-E型系统仅占4%。I-G型系统的Cas1和Cas3蛋白在菌株间高度保守（序列一致性>99%），CRISPR阵列的重复序列长度固定为36 bp， spacer数量集中于19或22个，且 spacer序列在不同菌株间高度一致。相比之下，I-E型系统表现出更高的多样性，其重复序列为29 bp， spacer数量和排列变异较大。这些结果表明I-G型系统是动物乳双歧杆菌中稳定且普适的基因组编辑基础。

内源性I-G型系统的编辑载体设计

研究以商业菌株Bl-04为模型，利用其内源性I-G型系统（包含Cas4-Cas1融合蛋白、Cas2、Cascade复合物Csb1-Csb3及Cas3核酸酶）构建编辑载体。载体包含人工CRISPR阵列（由天然启动子、重复序列、35 bp靶向spacer和终止子组成）和同源重组模板，通过Cas3介导的DNA降解对野生型基因进行反式选择。载体骨架经过优化，发现含pBC1复制子和氯霉素抗性标记（pBC1-cat）的质粒在Bl-04中的转化效率较原始pBC1-erm质粒提升20倍以上。

多靶点基因敲除与功能验证

针对Balac 1593-1601基因簇中的三个糖苷水解酶（Balac 1601、Balac 1596和Balac 1593）设计敲除方案。通过测试不同spacer（a-c）和同源臂长度（短臂600 bp、长臂1000 bp），发现长臂模板对较大缺失（如Balac 1601的749 bp缺失）更有效。编辑后质粒可在无抗生素培养基中经10代传代完全清除，实现迭代编辑。表型分析显示，Balac 1601（GH36 α-半乳糖苷酶）敲除株丧失利用棉子糖和蜜二糖的能力，而Balac 1596敲除引发碳源利用偏好改变（乳糖利用缺失、七叶苷利用增强），Balac 1593敲除未影响异麦芽糖利用，提示其他α-葡萄糖苷酶（如Balac 1573）可能补偿其功能。双敲除和三敲除株表现出非叠加表型，揭示了代谢网络的复杂性。

技术优势与应用前景

该编辑工具无需引入外源Cas蛋白，规避了转化难度和毒性问题，支持跨商业菌株的精准基因操作。其通用性为解析动物乳双歧杆菌的益生机制（如碳水化合物代谢、免疫调节）和开发高性能工程菌株提供了关键技术支撑。