鞭毛糖基化调控植物病原细菌在饱和多孔介质中的运移与沉积机制研究

《Applied and Environmental Microbiology》：How flagellar glycosylation of the phytopathogenic bacterium Pseudomonas amygdali pv. tabaci 6605 affects transport and deposition in saturated sandy porous media

本研究通过实验与模型模拟相结合，系统揭示了植物病原细菌Pseudomonas amygdali pv. tabaci 6605鞭毛糖基化对其在饱和砂质多孔介质中运移行为的影响。研究发现鞭毛表面疏水性是驱动细菌沉积的关键因素，糖基化通过引入亲水性糖链降低疏水性，显著增强细菌流动性并减少砂基质滞留。该成果为农业地下微生物污染风险评估和土壤生物修复策略提供了重要理论依据。

　　

鞭毛糖基化对植物病原细菌运移行为的影响机制

ABSTRACT

为缓解农田地下细菌污染，深入了解植物病原细菌在多孔介质中的运移和黏附机制对保护土壤和地下水至关重要。本研究通过实验观察和数值模拟相结合的方法，旨在阐明鞭毛及其糖基化对细菌在砂质多孔介质中运移和沉积的影响。鞭毛通过其表面特性在细菌运移和沉积动力学中发挥关键作用，其固有疏水性增强了细菌黏附并促进在砂粒上的沉积，同时限制了通过多孔介质的运移。然而，鞭毛蛋白糖基化引入了亲水性聚糖，通过增加细菌表面的整体亲水性来抵消这种效应，从而促进细菌流动性并提高流出物回收率，同时减少砂基质内的滞留。

INTRODUCTION

植物病原细菌通过土壤和水等地下环境的传播是植物感染的关键步骤，但目前对此了解甚少。众多环境因素和细菌因素会影响多孔介质中的运移和滞留，包括介质物理参数、流体特性以及细胞特征如形态、大小和表面电荷等。其中，鞭毛驱动的运动已成为影响细菌运移和附着的关键属性。细菌鞭毛是由旋转马达、钩状结构和作为螺旋推进器的长细胞外丝组成的复杂结构。除驱动运动外，鞭毛丝在表面附着中起关键作用，通常是细胞与表面的第一个接触点。在许多细菌物种中，丝主要由鞭毛蛋白（由fliC基因编码）组成。在已知植物病原菌Pseudomonas syringae中，鞭毛运动和fliC表达对于毒力和有效定殖至关重要。除基因存在和表达外，鞭毛蛋白的翻译后修饰（PTMs），特别是糖基化和甲基化，已被证明可调节细菌运动、黏附和宿主相互作用。鞭毛蛋白糖基化即在氨基酸残基上共价添加糖类，已在许多细菌物种中发现，并可影响蛋白质稳定性、折叠、免疫识别和功能，但其在动态条件下通过非生物多孔介质的细菌运移中的作用仍 largely unexplored。

MATERIALS AND METHODS

本研究使用的P. amygdali pv. tabaci菌株包括野生型（WT）、缺乏鞭毛的ΔfliC突变体，以及两个糖基转移酶突变体：产生非糖基化鞭毛的Δfgt1和表达部分糖基化鞭毛的Δfgt2。在WT中，鞭毛蛋白聚合物被O-糖基化，聚糖由两个或三个鼠李糖残基和一个末端修饰的4-氨基-4,6-二脱氧葡萄糖基（Qui4N）残基组成。细菌悬浮液制备使用King’s medium B基础肉汤。鞭毛纯化和表面疏水性测量采用先前描述的方法。运移实验使用内径3.4 cm、长18 cm的有机玻璃柱，均质Fontainebleau砂作为多孔介质。通过矩分析估算阻滞因子（R）和流出物质量平衡（M_eff）。采用包含两个动力学沉积位点的改进两区MIM模型模拟细菌运移，该模型将液相概念化为流动区和停滞区两个不同区域。

RESULTS

鞭毛蛋白表达降低细菌流动性并促进在多孔介质内的滞留

与缺乏鞭毛的ΔfliC菌株相比，WT菌株表现出更慢的运移速度，其阻滞因子更高（WT为0.70，ΔfliC为0.63），且在多孔介质中的滞留率更高（WT为65.04%，ΔfliC为52.53%）。ΔfliC菌株的流出物回收率（29.24%）显著高于WT（14.68%），表明鞭毛的存在通过增强表面相互作用阻碍了细菌运移。

鞭毛糖基化促进细菌通过砂的运移，导致更高的流出物回收率和减少的滞留

缺乏鞭毛糖基化的Δfgt1菌株表现出最快的运移速度（阻滞因子0.64），但其流出物回收率最低（10.56%），且在砂中的滞留率最高（73.46%）。部分糖基化的Δfgt2菌株的运移行为与WT相似（阻滞因子0.69），但其流出物回收率（21.08%）高于WT，滞留率（59.45%）低于WT。这表明糖基化程度影响了细菌的运移和沉积行为。

鞭毛疏水性降低细菌运移但促进沉积

Δfgt1突变体的鞭毛表面疏水性显著高于WT和Δfgt2菌株。鞭毛疏水性与细菌在砂中的滞留率呈强正相关（R2 = 0.89），与流出物回收率呈中等负相关（R2 = 0.70）。疏水性越强的菌株，其通过多孔介质的运移效率越低，在砂基质上的沉积倾向越高。

细菌优先运移及其沉积机制

MIM模型成功拟合了所有菌株的穿透曲线（R2 >0.93）。所有菌株的流动水分数（θ_m/θ）相似（0.64-0.68），表明64%-68%的孔隙体积参与了对流运移。WT菌株的弥散度最高（0.44 cm）。Δfgt2突变体的一级附着系数（k_att）显著降低（0.08 min^-1），表明部分糖基化损害了附着效率。WT菌株的脱附系数（k_d）最低（0.39 min^-1），而ΔfliC突变体最高（3.06 min^-1），表明WT菌株更可能发生不可逆附着。所有菌株的 straining 系数（k_str）量级相似（0.86-2.04 min^-1），表明物理截留是各菌株一致的滞留机制。

DISCUSSION

鞭毛不仅驱动运动，还在细菌黏附中发挥重要作用。缺乏鞭毛的ΔfliC菌株运移效率最高、滞留最低，与先前关于非鞭毛细菌在砂质介质中流动性更强的研究一致。WT菌株表现出更分散的流动行为，可能归因于鞭毛对细菌运动和与多孔介质相互作用的影响。鞭毛糖基化显著影响细菌运移，缺乏糖基化的Δfgt1菌株流出物回收率最低，糖基化可能通过稳定鞭毛丝结构来增强细菌在砂基质中的滞留。Δfgt1菌株表现出更高的从砂粒脱附倾向，其脱附系数高于糖基化的WT和Δfgt2菌株。缺乏鞭毛糖基化的菌株鞭毛疏水性最高，疏水性被确定为影响细菌沉积的主要因素。这些发现强调了鞭毛糖基化在调节细菌表面相互作用、环境持久性和病原体传播中的关键作用。

Conclusion

通过实验室柱运移实验，我们研究并量化了细菌菌株在砂质多孔介质中的运移和沉积行为，重点关注了鞭毛的作用和糖基化。通过观察与模型相结合，我们阐明了鞭毛疏水性对细菌回收和滞留的影响。我们的研究结果清楚地表明，鞭毛阻碍细菌运移并增强沉积，WT比ΔfliC菌株表现出更高的滞留，而ΔfliC菌株显示出更大的脱附潜力。Δfgt1菌株表现出更快的运移和更低的回收率，表明鞭毛糖基化有助于流出物回收并减少沉积。此外，增加的鞭毛疏水性被发现阻碍运移同时促进沉积。这项研究为评估农田植物病原细菌的风险和制定有效的土壤生物修复策略提供了关键见解。