GABA能信号在中枢神经系统中起着重要作用，它调节神经元兴奋性，并参与调节焦虑和应激反应[1]、睡眠[2]、运动控制[3]、情绪[4]、疼痛[5]、认知和学习[6]。GABAA受体是GABA能系统中的关键配体门控氯离子通道，负责介导快速抑制性神经传递，对维持神经平衡和防止过度兴奋至关重要。这一功能使它们区别于GABAB受体，后者为G蛋白偶联受体，参与较慢的调节性信号通路。除了内源性大麻素[7]或牛磺酸[8]外，GABAA受体主要由类固醇化合物[9]（如异孕烷醇酮（ALLO，3α-羟基-5α-孕烷-20-酮）或3α,5α-四氢脱氧皮质酮（THDOC））调节，这两种物质均作为正变构调节剂（PAMs）发挥作用。这些神经类固醇分别源自孕酮和脱氧皮质酮，通过与受体上的至少两个不同位点结合来增强受体功能[10]。在纳摩尔浓度下，神经类固醇作为正变构调节剂与α亚单位上的特定位点结合；而在微摩尔浓度下，它们可以直接与位于α和β亚单位交界处的位点结合，从而激活受体[11, 12]。这些相互作用通常会增加GABA诱导的氯离子电流的幅度和持续时间。虽然这些效应通常是有益的，但在某些情况下，它们也可能导致病理现象，如强迫症[13, 14, 15, 16]、肝性脑病、经前烦躁障碍（PMDD）或多囊卵巢综合征[17]。
本研究聚焦于GABAA受体调节类固醇拮抗剂（GAMSA），即那些能够特异性抑制PAMs对GABAA受体作用的分子，同时不改变受体对激动剂的响应，从而为直接受体阻断剂提供更安全的治疗选择（见图1A）。
一些具有GAMSA活性的类固醇是内源性产生的，例如异孕烷醇酮（IsoALLO，3β-羟基-5α-孕烷-20-酮，见图1B）。作为ALLO的3β-异构体，IsoALLO在多种GABAA受体亚型（包括α1β2γ2）上均表现出GAMSA活性[18]。它可能在ALLO的结合位点起拮抗作用，表明体内存在一种天然的平衡机制[13]。其GAMSA特性已在多项研究中得到证实：在大鼠皮质匀浆中[19]，以及在啮齿动物模型和人类体内[17, 18, 20, 21]。IsoALLO目前正以“塞普拉诺酮（sepranolone”之名进行临床试验，用于治疗图雷特综合征和其他强迫症[22, 23]。
虽然塞普拉诺酮为GAMSA的研究开辟了道路并展示了其治疗潜力，但开发新的类似物对于优化药物特性、扩大治疗应用范围和降低研发风险至关重要。然而，新GAMSA的发现速度较慢——目前仅有的合成GAMSA候选物是戈莱克萨诺酮（Glexanolone，GR3027）和GR3049[24]。我们认为这主要是由于缺乏快速、高通量且经济可行的方法学手段。迄今为止，所有关于GAMSA化合物的研究都依赖于手动膜片钳技术[17, 26]。尽管该技术因灵敏度高和能够直接测量离子电流而被视为研究离子通道的“金标准”，但它耗时费力，需要专业操作人员，因此不适用于大规模化合物库的筛选。此外，类固醇化合物在手动膜片钳实验中容易吸附在管路壁上，需要多次清洗，进一步增加了实验时间。自动膜片钳系统虽然部分解决了这一问题，但价格昂贵且同样需要专业操作人员[27]。
为了加速新GAMSA的发现，高通量筛选（HTS）方法至关重要。本研究描述的方法采用稳定表达GABAA α1β2γ2受体的CHO细胞，通过检测GABAA通道激活时膜电位的变化来进行测定。当氯离子通过受体进入细胞时，膜电位会发生变化，可以使用电压敏感荧光染料进行测量。
该方法的显著优势在于其便捷性：仅需常见的、价格合理的实验室设备（如标准液体分配器和平板读数仪），无需专用仪器（如FLIPR或膜片钳），便于推广。这种方法成本低廉、易于自动化，能够快速筛选大量化合物库，是早期药物开发中的宝贵工具。除了识别GAMSA外，通过从反应混合物中去除ALLO，该方法还可用于筛选非GAMSA受体调节剂。为了验证该方法的通用性，我们测试了108种内源性类固醇对GABAA受体的正向和负向调节作用以及可能的GAMSA活性。
使用更复杂的低通量技术对部分候选化合物进行验证仍是GAMSA发现过程中的必要步骤。基于荧光的测定方法容易受到实验误差的影响，可能导致假阳性结果，这可能是由于脱靶效应或化合物与探针的相互作用[27]。
