《Analytica Chimica Acta》：Rapid and One-pot Detection of Nucleic Acids within mRNA Vaccines Based on a Dual Amplification Strategy with PER-CSD
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mRNA疫苗检测新方法：基于PRR-CSD双信号放大的荧光生物传感器实现快速、简便的非小细胞肺癌mRNA疫苗分析，通过闭环双锤结构增强稳定性和特异性，40分钟内完成单步恒温检测。
Feifan Yin | Miao He | Han Pan | Murilege Chao | Jinhua Chen | Qiufeng Wang | Wenting Cheng | Zhongyun Wang | Yang Xiang
中国南京大学生命科学学院药物生物技术国家重点实验室，南京 210023
结果
在本研究中，我们基于引物交换反应（PER）和催化链置换（CSD）建立了一种新型分析平台，实现了非小细胞肺癌（NSCLC）mRNA疫苗的一步法和快速检测。具体而言，目标分子能够激活上游的PER反应，该反应具有完全封闭的哑铃形发夹结构，从而产生大量的触发分子。随后，触发分子与探针上暴露的带荧光基团的趾部区域结合，启动CSD过程并产生明显的荧光信号。在该系统中，触发分子可以循环使用，以实现信号的第二阶段放大。此外，这种策略能够以等温、快速和一步法的方式实现双重信号放大。
意义
最终，本研究创新性地开发了一种基于引物交换反应和催化链置换的荧光生物传感器，实现了双重信号放大，实现了快速、一步法和等温检测。完全封闭的哑铃形发夹结构提高了稳定性并降低了背景噪声。这些进展为mRNA疫苗中核酸的体外检测提供了一个方便且用户友好的平台，并可能为其他mRNA治疗方法的开发提供可扩展的检测平台。
引言
肺癌是全球癌症死亡的主要原因之一，每年导致约176万人死亡[1]。根据组织学分类，非小细胞肺癌（NSCLC）占肺癌病例的绝大多数，约为85%，整体生存率较低[2][3]。在过去十年中，与手术切除、靶向治疗和放疗相比，基于免疫疗法的治疗方法为NSCLC的治疗模式带来了新的变化[4][5]。作为免疫疗法的前沿技术，肿瘤mRNA疫苗的核心原理是利用编码肿瘤相关抗原（TAAs）或肿瘤特异性抗原（TSAs）的mRNA分子，从而引导机体免疫系统产生特异性反应[6][7]。与DNA疫苗不同，mRNA避免了基因组整合的风险，并具有短暂表达的特性，可以精确调控免疫持续时间[8]。目前，mRNA疫苗的研究已顺利进入临床阶段，并取得了积极的结果和进展[9][10]。肿瘤mRNA疫苗能够刺激适应性免疫和先天免疫，提供长期免疫记忆，并同时针对多种肿瘤相关抗原。肿瘤mRNA疫苗的活性药物成分（API）是合成的mRNA。因此，构建用于检测这些核酸的分析方法具有重要意义，这在mRNA疫苗的分析中具有应用潜力。
现有的传统核酸检测技术可以实现mRNA的检测[11][12]。然而，由于技术门槛高、操作复杂且成本昂贵，这些方法在临床诊断中的应用存在一定限制。值得注意的是，核酸等温扩增技术是一种简单的方法，能够在恒定温度下快速高效地积累核酸序列，无需PCR所需的热循环[13]。该技术已应用于DNA、RNA、细胞和蛋白质等生物传感目标[14][15][16]，包括环介导的等温扩增（LAMP）[17]、链置换扩增（SDA）[18]、指数扩增反应（EXPAR）[19][20]、滚环扩增（RCA）[21][22]和重组酶聚合酶扩增（RPA）[23][24]等多种方法。与其他基于聚合酶的方法不同，引物交换反应（PER）可以独立编程合成特定序列的单链DNA，在生物传感器构建中展现出广阔的应用前景[25]。例如，最近的研究将PER与CRISPR、RNA适配体和金属有机框架等先进技术结合，用于核酸分析[26][27][28]。在分子诊断领域，PER在早期疾病检测方面具有巨大潜力[29][30]。荧光生物传感器是一种将生物识别组件与光学检测方法结合的分析装置，用于识别和定量特定目标分子。测得的荧光信号可以与样品中分析物的浓度定量相关联，实现高灵敏度和选择性检测[31][32]。
基于上述内容，我们提出了一种基于引物交换反应（PER）和催化链置换反应（CSD）的新型荧光生物传感器，专为NSCLC mRNA疫苗的高特异性和敏感性检测而设计。通过设计完全自锁的PER发夹结构，增强了反应探针的稳定性，并限制了背景信号的产生。PER发夹的环部分经过特殊设计，包含能够特异性识别目标mRNA的互补序列。当目标mRNA存在时，会破坏发夹的封闭结构，暴露出引物结合区域，从而顺利启动PER扩增。在DNA聚合酶的延伸作用下，引物根据模板序列扩展，积累大量单链DNA起始物，触发下游反应。随着上游PER产物释放出大量单链DNA，随后激活二次信号放大。PER产物通过暴露的趾部区域引发第一次链置换反应，使含有淬灭基团的DNA探针与荧光链分离，从而实现荧光信号恢复。在DNA聚合酶的作用下，进一步催化第二次链置换反应，释放PER产物并激活更多的CSD反应。值得注意的是，PER-CSD分析系统的实施过程快速、一步法且等温，表现出良好的选择性、稳定性和通用性。这为肿瘤mRNA疫苗的临床药代动力学研究提供了一种新的分析方法，在分子诊断和即时检测（POCT）领域具有巨大的应用价值和实际意义。
材料
本分析策略中使用的DNA和RNA序列及相关修饰由上海Sangon Biotechnology有限公司提供。详细序列见支持信息中的表S1。Bst DNA聚合酶（大片段）购自美国New England Biolabs公司。NaCl、MgCl2和TEMED购自上海Aladdin Biochemical Technology有限公司。DEPC-H2O、1×TE缓冲液（不含DNase和RNase）以及100 mM dATP/dTTP/dCTP也由该公司提供。
提出的生物传感平台原理
总体而言，图1详细展示了由目标分子激活的双重信号放大的PER-CSD策略。通过合理的设计，我们构建了一个完全封闭的哑铃形发夹结构（FHP）。FHP主要由目标识别区（绿色片段）、引物捕获区（橙色片段）、模板延伸区（蓝色片段）和阻断区（黑色片段）组成。在目标mRNA存在的情况下
结论
总结来说，我们根据PER级联CSD原理精心构建了一种用于mRNA疫苗中核酸快速一步法检测的新传感平台。该策略具有以下优点：（1）采用一步法检测，操作简单，在等温条件下40分钟内完成反应，无需复杂的热循环；（2）信号差异在室温下即可清晰观察到。
CRediT作者贡献声明
Jinhua Chen：方法学设计。
Qiufeng Wang：实验研究。
Wenting Cheng：实验研究。
Zhongyun Wang：资源获取、资金筹措。
Yang Xiang：写作、审稿与编辑、监督、方法学设计、资金筹措、概念构思。
Feifan Yin：原始稿撰写、验证、方法学设计、实验研究、概念构思。
Miao He：验证、实验研究。
Han Pan：实验研究。
Murilege Chao：方法学设计。
利益冲突声明
作者声明没有已知的利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
本工作得到了中国国家自然科学基金（项目编号82371283、82571445、81672570）、国家仿生药物重点实验室（项目编号K202009）以及江苏省自然科学基金（项目编号BK20240264）的支持。
