《Aquaculture》：Establishment of a TaqMan qPCR assay for the rapid detection and quantification of
Nocardia seriolae in aquaculture
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诺卡氏菌检测方法研究：开发高灵敏度TaqMan qPCR技术用于水产养殖环境及组织样本，检测率91.7%优于传统PCR25%，发现肝脏、脾脏、肾脏和肠道为感染主要器官，细菌载量0.57-3.74 copies/ng。
陈泽霞|杨宇|朱天生|宋超伟|王子军|刘子彦|蔡冉|罗雷|苗向军|李文生|孙彩云
中国广东省生物控制国家重点实验室，水生经济动物重点实验室，广州
摘要
由Nocardia seriolae引起的诺卡菌病是一种慢性全身性疾病，在早期阶段难以检测，后期治疗也具有挑战性，导致水产养殖业遭受重大经济损失。本研究开发了一种特定的TaqMan qPCR检测方法，用于快速检测和定量水培水体和鱼类中的N. seriolae。特异性引物(GntRs-F/R)和探针(GntRs-P)是根据不同Nocardia物种的GntR家族转录因子的多氨基酸序列比对设计的。质粒拷贝数与Cq值之间的线性关系可用方程y = ?3.3248×+42.261表示，R2值为0.9965，扩增效率为99.9%。此外，该检测方法具有高灵敏度、强特异性、良好的重复性、低变异性、广泛适用性和高准确性。在21个水培水体样本和27个杂交鳊鱼组织样本中，使用该方法的阳性检出率为91.7%，比传统PCR方法提高了25%。对杂交鳊鱼中N. seriolae的组织分布分析显示，免疫器官（肝脏、脾脏和肾脏）和消化器官（胃和肠道）是感染的主要目标。感染过程中，这些组织中的N. seriolae细菌载量逐渐增加，范围从0.57到3.74拷贝/ng。本研究的方法为诊断鱼类诺卡菌病以及阐明N. seriolae动态与水产养殖疾病暴发之间的关系提供了有价值的工具。
引言
Nocardia seriolae是一种革兰氏阳性、细胞内放线菌，具有分枝丝状形态。它是一种兼性病原体，生长缓慢，需氧代谢，并能耐受微酸性环境（Xu等人，2022年）。这种细菌是诺卡菌病的致病菌，该病是一种慢性全身性疾病，潜伏期长且死亡率较高。由于临床症状不典型，早期诺卡菌病难以检测。随着疾病进展，病理表现变得明显，而传统治疗方法效果不佳，导致养殖鱼类死亡率高（Liu等人，2025年；Nawaz等人，2022年；Semwal等人，2023年）。受感染的鱼类常表现出食欲减退和游泳活动减少等行为异常。随着病情发展，外部症状也会出现，如皮肤溃疡、鳃和皮下出血、腹部膨胀以及肛门发红（Maekawa等人，2018年）。对受感染鱼类的尸检通常会发现腹腔积液以及内脏器官（包括肝脏、脾脏、肾脏和肠道）中散布的大量白色结节（Liu等人，2023年；Zhou等人，2024年）。最近的研究证实N. seriolae是诺卡菌病的主要致病菌（Del Rio-Rodriguez等人，2021年；Le等人，2022年；Liu等人，2023年；Shimahara等人，2008年）。N. seriolae可以感染多种海洋和淡水鱼类，包括Seriola quinqueradiata（Kubota等人，1968年）、Larimichthys crocea（Wang等人，2005年）、Morone saxatilis（Shimahara等人，2008年）、Channa argus（Wang等人，2007年）、Micropterus salmoides（Shimahara等人，2010年）和Trachinotus ovatus（Xia等人，2015年）。因此，诺卡菌病对水产养殖业构成重大威胁，造成巨大经济损失。
目前，尚无针对诺卡菌病的特异性或高效药物，养殖户主要依靠抗生素和水质管理来控制该疾病。然而，宿主的炎症反应会导致病原体被免疫细胞包裹，形成肉芽肿（Fang等人，2017年；Liu等人，2023年；Wang等人，2017a，2017b；Zhou等人，2024年）。这种包裹现象阻碍了抗生素的有效渗透，限制了其治疗效果。此外，过度使用抗生素还会促进耐药细菌的出现，并导致环境污染。另外，其他一些病原体，如Aeromonas hydrophila（Samayanpaulraj等人，2020年；Semwal等人，2023年）、Piscirickettsia salmonis（Fryer和Hedrick，2003年）以及Photobacterium damselae亚种piscicida（Gouife等人，2022年；Romalde，2002年），也会引起类似诺卡菌病的临床症状，从而使得仅凭病理症状进行鉴别诊断变得复杂（Zheng，2022年）。因此，建立一种特异性强、检测快速且灵敏的N. seriolae检测方法对于早期诊断和监测至关重要，为养殖户提供可靠依据，以便及时采取有效策略预防诺卡菌病暴发。
传统的病原体分离和鉴定方法具有高准确性。然而，由于这种细菌生长缓慢、实验程序繁琐且需要熟练人员，这些方法并不适合快速检测N. seriolae（Austin，2019年）。相比之下，分子诊断方法已成为疾病检测的重要工具，常用的技术包括PCR、qPCR、TaqMan qPCR、dPCR和LAMP（Jaies等人，2024年）。其中，TaqMan qPCR特别具有优势，它使用序列特异性的荧光探针，在探针水解时产生可检测信号，从而实现目标基因的定性和定量检测。由于其高灵敏度、特异性和重复性，该方法已被广泛应用于多个领域，如传染病的早期检测、食源性病原体的鉴定、动物疾病监测以及RNA干扰介导的基因沉默评估（Karlen等人，2007年；Lanciotti等人，2000年；Postollec等人，2011年；Volkmann等人，2004年；Watson和Li，2005年）。由于Nocardia物种之间的密切系统发育关系和高度保守的基因组，传统的管家基因如16S rRNA、gyrA/B、rpoB/D和hsp65在序列上具有高度相似性（Conville等人，2018年），因此很难找到足够短且具有物种特异性的扩增子用于分子诊断。相比之下，GntR家族是最广泛分布的细菌转录调控因子之一。先前的研究表明，GntR蛋白的N端螺旋-转角-螺旋结构域相对保守，而C端效应子结合域在不同Nocardia物种间差异较大（Rigali等人，2002年）。这种结构差异使得可以在N. seriolae的C端区域识别出长度合适且高度特异的扩增子，使其成为开发物种特异性分子检测方法的理想目标。
杂交鳊鱼（Channa argus × Channa maculata）属于鲈形目Channa属的底栖鱼类。这种鱼类具有耐低氧、耐低温和适应水质不佳环境的优势（Ou等人，2018年），同时具有很高的药用和食用价值，因此受到养殖户和消费者的青睐。然而，杂交鳊鱼多年来一直受到诺卡菌病的影响（Wang等人，2007年），这种疾病严重阻碍了杂交鳊鱼养殖业的发展。
在水产养殖中，诺卡菌病的暴发与养殖环境中N. seriolae的丰度密切相关。因此，需要持续监测水培水体和鱼类组织中的N. seriolae水平。环境DNA（eDNA）技术可以从水、土壤、沉积物、雪和空气等环境样本中直接提取DNA片段（Ficetola等人，2008年；Willerslev等人，2007年），为这种监测提供了可靠的方法。尽管基于eDNA的方法具有潜力，但针对N. seriolae的有效检测方法仍然有限，这给准确定量带来了挑战，也是相关研究的重要瓶颈。此外，阐明N. seriolae在受感染鱼类中的组织分布和时间动态对于理解其感染机制和致病机理至关重要。然而，目前尚未有相关研究报道这些方面。
本研究旨在开发一种用于特异性检测N. seriolae的TaqMan qPCR方法，然后将其与eDNA技术结合，以实现水培水体和鱼类组织中N. seriolae的快速检测和定量。进一步利用该方法研究了受感染鱼类中N. seriolae的组织分布和时间动态。通过实现精确的检测和定量，该方法为阐明N. seriolae的感染过程和致病机理提供了重要技术支持。更重要的是，它还为评估N. seriolae的环境水平与水产养殖系统中诺卡菌病发生之间的关系提供了有力工具，从而有助于早期预警和预防策略的制定。
实验材料
从8种不同的鱼类中分离出了8株N. seriolae：Channa argus、杂交鳊鱼（Channa argus♂ × Channa maculata♀）、Micropterus salmoides、Lateolabrax japonicus、Scortum barcoo、Trachinotus ovatus、Hypophthalmichthys molitrix和Clarias fuscus。所有菌株均由中国渔业科学院珠江渔业研究所的李凯斌教授提供。
Escherichia coli、Streptococcus agalactiae、Priestia megaterium、Bacillus
引物和探针设计
不同Nocardia物种的GntR家族转录因子的氨基酸序列比对显示C端存在显著种间差异（图2）。该区域被选为TaqMan qPCR检测N. seriolae的引物和探针设计的目标位点。
标准曲线
标准曲线是通过重组质粒的10倍系列稀释生成的，在9.72×1010到9.72×101拷贝范围内显示出强烈的线性关系。
讨论
已有报道多种Nocardia物种是水产养殖中的病原体，包括N. seriolae、N. asteroides、N. salmonicida、N. crassostreae和N. brasiliensis（Acosta等人，2024年；Friedman和Hedrick，1991年；Kariya等人，1968年；Maekawa等人，2018年；Nayak等人，2014年；Orchard，1979年）。其中，N. seriolae的致病性最强，能够感染约42种鱼类，尤其在亚洲水产养殖中造成重大经济损失。
结论
总之，本研究建立了一种具有高灵敏度、强特异性、良好重复性、广泛适用性和高准确性的TaqMan qPCR方法。结合eDNA技术，该方法能够快速检测和定量水培水体和鱼类组织中的N. seriolae》。这些发现为诺卡菌病的早期预测和诊断提供了有效工具，并有助于研究与该疾病暴发相关的环境因素。
CRediT作者贡献声明
陈泽霞：验证、方法学、研究、概念化。杨宇：方法学、研究。朱天生：研究、正式分析。宋超伟：研究、概念化。王子军：研究。刘子彦：研究。蔡冉：正式分析。罗雷：正式分析。苗向军：研究。李文生：监督、项目管理、资金获取。孙彩云：撰写——审稿与编辑、撰写——初稿、监督、项目
未引用参考文献
Tzafesta和Shokri，2025年
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究工作。
致谢
本工作得到了中国农业研究系统（CARS-46）、国家自然科学基金（31972770）和广东省自然科学基金（2025A1515010768）的支持。
