《mSystems》：Spatial metabolomics reveals the role of penicillic acid in cheese-rind microbiome disruption by a spoilage fungus
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本研究通过空间代谢组学（MALDI-MSI）与多组学技术结合，揭示了腐败真菌Aspergillus westerdijkiae通过产生青霉酸（PA）、赭曲霉素B（OTB）等霉菌毒素，以物种特异性和空间靶向性的化学策略破坏奶酪皮有益细菌群落的机制，为理解发酵食品中微生物互作及防控真菌性腐败提供了新见解。
微生物相互作用在奶酪皮中影响着群落结构、食品安全和产品质量。然而，在奶酪和其他发酵食品中介导微生物相互作用的化学机制大多未知。本研究调查了腐败霉菌Aspergillus westerdijkiae如何利用组学技术组合化学抑制有益的奶酪皮细菌。
在奶酪皮群落和共培养实验中，A. westerdijkiae强烈抑制了大多数奶酪皮群落成员。在与Staphylococcus equorum共培养时，A. westerdijkiae强烈影响细菌基因表达，包括上调一个推定的bceAB基因簇，该簇在其他细菌中与抗菌化合物抗性相关。质谱成像（MALDI-MSI）揭示了次级代谢物在真菌-细菌界面处的空间局部化生产，包括青霉酸和赭曲霉素B（与Brachybacterium alimentarium相互作用时）。液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）和基因组注释的整合确认了其他生物活性代谢物的存在，如notoamides和circumdatins。真菌代谢反应因细菌伙伴而异，表明了物种特异性的化学策略。值得注意的是，在与B. alimentarium相互作用期间，青霉酸水平增加了2.5倍，并且纯化青霉酸实验显示以剂量依赖方式抑制这种皮细菌。这些发现表明A. westerdijkiae部署了一套情境依赖的霉菌毒素和其他代谢物，破坏了奶酪皮中的微生物群落组装。
Aspergillus westerdijkiae抑制奶酪皮细菌的生长并改变其基因表达
研究首先通过模型洗涤皮奶酪群落实验评估了A. westerdijkiae的影响。实验群落包含代表洗涤皮奶酪主要微生物的细菌和真菌。在20°C和15°C条件下，有益皮细菌和真菌（不包括Aspergillus）的总生长显著降低，但在10°C的最冷温度下没有显著差异。群落组成分析显示，温度和A. westerdijkiae的存在及其交互作用对群落结构有显著影响，但A. westerdijkiae对群落结构的影响仅在20°C和15°C较高温度下观察到，在10°C下未观察到。这些实验表明A. westerdijkiae可以强烈抑制理想的奶酪皮细菌，但这些效应仅在高温下观察到。
配对共培养试验显示，A. westerdijkiae显著抑制了大多数测试微生物菌株的生长，尤其是细菌物种Staphylococcus equorum和Brachybacterium alimentarium。丝状真菌Fusarium domesticum也被高度抑制，而酵母Debaryomyces hansenii的抑制程度最轻。
对S. equorum的转录组分析揭示了该细菌对A. westerdijkiae存在的强烈转录组反应，有417个基因上调和488个基因下调。通路富集分析识别出强烈的转录反应，包括各种营养获取通路的上调。一个强烈上调且不寻常的转录组反应是推定的bceAB簇的上调，这表明当细菌与抑制性真菌共培养时，它们可能使用BceAB转运蛋白等系统来应对真菌产生的抗菌化合物。
预测的A. westerdijkiae代谢物及其在与细菌相互作用期间的空间靶向生产
为了研究观察到的抑制和转录反应背后的潜在抗菌化合物，使用antiSMASH分析了A. westerdijkiae基因组以预测其生物合成基因簇（BGCs）。该分析揭示了与已知的赭曲霉素A（OTA）、ochrindole A和notoamide A簇具有高度同线性和至少50%序列同一性的簇，表明A. westerdijkiae拥有产生这些生物活性化合物及其结构类似物的生物合成机制。
利用MALDI-MSI对A. westerdijkiae和B. alimentarium共培养物进行分析。表型上，共培养区定义了真菌-细菌相互作用（FBI）区和细菌-细菌相互作用（BBI）区两个关键区域。虽然未在空间分析中检测到OTA，但观察到了赭曲霉素B（OTB）的清晰信号。类似地，检测到了ochrindole A及其结构类似物ochrindole C，以及notoamide A。这些检测到的代谢物主要定位于FBI区，强度增加。这种空间分辨模式表明A. westerdijkiae将特定次级代谢物（包括结构类似物）的生产导向其细菌竞争者。
为了增强代谢物注释并发现其他真菌化合物，使用LC-MS/MS分析了这些纯培养和共培养物的提取物，然后通过GNPS平台进行经典分子网络分析。分子网络揭示了结构相关的真菌代谢物家族，包括在与B. alimentarium相互作用期间富集的青霉酸（PA）、circumdatin A、B和F。这些化合物的空间分布与它们在FBI区的富集一致，进一步支持了它们在种间相互作用中的作用。
LC-MS确认霉菌毒素OTB和PA的生产
在相互作用试验中注释的代谢物中，化合物OTB和PA基于其有据可查的毒性与食品安全相关性以及在MALDI-MSI实验中的显著空间定位而成为验证的关键候选物。为了确认其身份，对在相同空间相互作用设置下生长的A. westerdijkiae和B. alimentarium共培养物提取物进行了LC-MS分析。与商业标准品共注射显示了对应于OTB和PA的共洗脱峰。标准品的精确质量与提取物中预期的质子化分子匹配。此外，无标准品时粗提物的色谱图显示，与真菌纯培养物相比，共培养条件下OTB和PA的相对离子强度更高，表明细菌存在增加了这些霉菌毒素的生产。
霉菌毒素生产随细菌伙伴和相互作用类型而变化
接下来研究了关键真菌代谢物的生产是否受细菌相互作用伙伴身份的影响。提取离子色谱图（EICs）显示，与A. westerdijkiae纯培养物相比，化合物OTB和PA在与B. alimentarium的共培养物中显著上调。值得注意的是，PA在BBI区也被检测到，尽管相对强度较低，表明该化合物可能扩散到直接的FBI界面之外。相比之下，与S. equorum的共培养物未表现出任一代谢物的类似上调。这些结果表明物种特异性的真菌代谢反应，A. westerdijkiae在B. alimentarium存在下分泌更高水平的霉菌毒素，但在S. equorum存在下则不分泌，突出了真菌化学防御的情境依赖性。
鉴于在Brachybacterium共培养物中观察到PA更高的相对离子丰度和更广的空间分布，在不同相互作用条件下对该霉菌毒素进行了靶向定量。使用LC-MS，首先从每个样品的EICs中提取PA的峰面积，然后使用纯化PA生成的标准校准曲线将这些值转换为绝对浓度。定量针对A. westerdijkiae纯培养物、与B. alimentarium和S. equorum的共培养物以及相应的BBI区进行。
与真菌纯培养物和S. equorum相互作用相比，A. westerdijkiae–B. alimentarium共培养物的原始峰面积显著更高。当将这些峰面积转换为浓度时，与B. alimentarium的共培养物 consistently showed the highest levels of PA。相比之下，A. westerdijkiae纯培养物和S. equorum共培养物产生的浓度 substantially lower。在Brachybacterium平板的BBI区也检测到PA，尽管浓度低于直接FBI。这种模式表明代谢物从相互作用区扩散出去，随着距相互作用界面距离的增加而减弱。
PA对奶酪皮细菌表现出抗菌活性
为了确认PA对单个奶酪皮细菌生长的影响，在CCA中补充了不同浓度的这种纯化霉菌毒素（10、100和1,000 μM），并监测了10天。结果揭示了 distinct, species-specific responses。与上述化学数据一致，Brachybacterium显示出清晰的剂量依赖性抑制，随着PA水平上升，生长 increasingly suppressed。相比之下，Staphylococcus似乎 largely unaffected，表现出轻微的生长减少，并且 mostly impacted only at the highest concentration。Psychrobacter特别敏感，PA在所有测试浓度下 strongly inhibiting its growth。有趣的是，Brevibacterium在较低剂量下以相反方式响应，在10和100 μM时显示 enhanced growth，尽管这种刺激效应在1,000 μM时消失，再次观察到抑制。
讨论
本研究整合了群落和配对多组学来研究腐败真菌A. westerdijkiae对洗涤皮奶酪中细菌的化学信号传导。最初的相互作用试验表明A. westerdijkiae强烈抑制常见的奶酪皮相关细菌（包括B. alimentarium和S. equorum）的生长，并诱导S. equorum的转录变化。这些发现促使开发了一个使用CCA的空间模型系统，使我们能够在空间结构化环境中分析微生物代谢物。我们的结果表明A. westerdijkiae表现出物种特异性的次级代谢物生产，针对不同的细菌竞争者选择性部署霉菌毒素和其他生物活性化合物。这些发现突出了腐败真菌如何通过情境依赖的化学策略改变微生物群落动态。
A. westerdijkiae产生定位于FBI的 distinct metabolites，表明空间定向的化学干扰。诸如OTB、ochrindoles A和C、notoamide A、PA以及circumdatins A和B等化合物在与B. alimentarium相互作用位点特异性富集，表明代谢物生产不是均匀的，而是响应竞争者存在而空间调节的。这些代谢物的空间分布也与它们已知的生物学活性一致，加强了它们在微生物竞争中的功能相关性。
尽管存在与OTA高度相似的BGC，但我们 consistently detected only OTB in our data sets。这表明将OTB转化为OTA的最终氯化步骤可能是环境调节的，可能需要我们实验设置中未复制的特定非生物或生物条件。或者，也可能OTA的生产量相对于OTB较低，并且低于我们分析方法的检测限。
空间代谢组学数据揭示，霉菌毒素PA和OTB compared to other metabolites分布在更广的区域。这种更广的扩散可能反映了它们更高的效力和真菌防御中的功能重要性，使A. westerdijkiae能够施加影响 beyond the immediate interaction zone。
我们的数据揭示A. westerdijkiae根据相互作用的细菌物种的身份调节其次级代谢物谱。当与B. alimentarium共培养时，真菌产生了显著更高水平的PA和OTB。这些化合物在与S. equorum相互作用期间没有被类似诱导，指向一个量身定制的响应 rather than a general stress reaction。与这些物种特异性化学响应一致，纯化PA的直接补充揭示了个体奶酪皮细菌对这种代谢物的敏感性 vary markedly。这些生长表型 mirror the trends observed in our co-culture and spatial metabolomics analyses，加强了A. westerdijkiae利用PA作为奶酪皮微生物组内选择性、情境依赖性化学武器的结论。
更广泛地说，我们的发现支持了微生物群落不仅由营养竞争和环境过滤塑造，而且也由 active, chemically mediated antagonism 塑造的观点。像A. westerdijkiae这样的真菌使用模块化和动态的化学武器库，使它们能够灵活应对生态压力。
结论
尽管我们的模型系统捕捉了奶酪皮生态学的关键方面，但相对于原位微生物群落的全部复杂性而言，它本质上是简化的。由于自然环境中微生物群落组装涉及额外的非生物梯度和微生物参与者，未来的工作应评估这些发现在多物种系统或真实奶酪皮中是否成立。一个特别重要的下一步是评估破坏如PA或OTB等化合物的生物合成是否会改变群落组成。总之，我们的结果表明A. westerdijkiae在奶酪皮微生物组中对细菌竞争者表现出物种特异性和空间靶向性的化学响应。我们揭示了这种入侵真菌如何响应微生物情境调节其次级代谢，以选择性、界面导向的方式产生霉菌毒素和结构多样的代谢物。这些发现为理解发酵食品模型系统中微生物干扰的真菌策略提供了新见解。
