网络药理学与生物信息学的综合分析揭示了斑蝥素和人参皂苷Rg3对肝癌细胞的协同抗肿瘤作用

《Biochemical Pharmacology》：Integrative analyses of network pharmacology and bioinformatics reveal the synergistic antitumor effects of cantharidin and ginsenosides Rg3 on hepatocellular carcinoma

肝细胞癌（HCC）治疗研究显示，斑蝥素（CTD）与人参皂苷Rg3联合通过多靶点机制抑制肿瘤增殖、迁移和侵袭。多组学分析表明其协同作用涉及代谢重编程和免疫微环境调控，鉴定出AKR1D1、SLC16A4和ALDH3B1为关键靶点，其中ALDH3B1被证实与免疫微环境重塑相关，且CTD/Rg3均与其高亲和结合。临床数据验证靶点激活与抑制状态，证实联合治疗具有显著抗HCC效果，为传统医学协同疗法提供分子依据。

　　

苟向刚|周忠正|王月华|袁Henye|王子瑶|陈杰|严伟|王海生|严佳

内蒙古医科大学基础医学院，中国内蒙古自治区呼和浩特市回民区新华街1号

摘要

Cantharidin（CTD）在传统中医（TCM）中已被广泛应用，并显示出显著的抗肿瘤活性，尤其是在肝细胞癌（HCC）中。然而，其临床前转化受到剂量限制毒性的显著制约。受到传统Mylabris和人参组合的启发，我们研究了CTD与人参皂苷Rg3（Rg3，最常见和生物活性最强的人参皂苷之一）在对抗HCC中的协同作用。研究发现，CTD/Rg3联合治疗能够协同抑制HCC细胞的增殖、迁移和侵袭。通过多组学分析，揭示了CTD/Rg3联合疗法在HCC治疗中的多靶点和多途径机制。功能富集分析表明，CTD/Rg3的作用靶点与代谢途径和免疫反应密切相关。进一步筛选发现AKR1D1、SLC16A4和ALDH3B1是潜在的药物靶点。与肝癌患者的临床数据相关性分析显示，在CTD/Rg3干预过程中，AKR1D1和SLC16A4被激活，而ALDH3B1被抑制。分子对接研究进一步证明，CTD和Rg3都能高亲和力且稳定地结合到ALDH3B1的活性位点上，而ALDH3B1与HCC中的免疫微环境重塑有关。总体而言，我们的研究结果表明，CTD/Rg3联合疗法通过多靶点机制发挥强大的抗HCC作用。通过同时调节代谢途径和免疫反应，这种策略为HCC治疗提供了一种新的整合方法。这些结果不仅阐明了CTD/Rg3的分子作用机制，还为其在HCC临床应用提供了有力的临床前支持。

引言

肝癌是全球诊断频率第六高的恶性肿瘤，也是癌症相关死亡的第三大原因，构成了重大的公共卫生负担[1,2]。肝细胞癌占原发性肝癌病例的75-85%，是主要的组织学亚型[3]。HCC的临床管理面临巨大挑战，超过70%的患者在诊断时已处于中期或晚期，因此无法进行根治性手术切除[4,5]。系统性治疗，包括化疗、分子靶向药物和基于免疫检查点阻断的免疫疗法，是晚期HCC的主要治疗手段[[6], [7], [8]]。尽管取得了这些进展，但仍存在治疗相关毒性大、药物耐药性产生以及晚期疾病疗效不佳等问题。特别是，大约40-60%的患者会对免疫检查点抑制剂（ICIs）产生原发性或适应性耐药性，这促使人们开发包含辅助免疫调节剂的联合治疗方案[9,10]。同时，与代谢功能障碍相关的脂肪性肝病（MASLD）相关的HCC发病率不断上升，预计到2030年将占病例的30%，这凸显了基于机制的代谢疗法的迫切需求[11]。因此，合理设计的联合疗法成为关键策略，尤其是针对晚期HCC这一关键未满足的治疗需求。

中医是中国综合癌症管理的重要组成部分。近几十年来，中医已发展成为一种基于证据的辅助治疗手段，越来越多的研究证实了其在HCC中的治疗潜力[12,13]。多种生物活性化合物已被证实通过多种机制发挥多靶点抗肿瘤作用，包括调节多种途径和重塑肿瘤微环境[14]。新兴证据表明，中医具有多方面的免疫调节作用，对癌症免疫疗法具有治疗意义[15,16]，包括通过激活自然杀伤（NK）细胞、树突状细胞成熟和M2巨噬细胞极化来调节先天免疫[17,18]；通过促进CD8+细胞毒性T细胞扩增和平衡CD4+辅助T细胞亚群来增强适应性免疫[19]；以及调节促炎细胞因子网络，如白细胞介素-2（IL-2）、干扰素-γ（IFN-γ）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和PD-1/CTLA-4检查点表达[[20], [21], [22]]。此外，中医不仅与传统抗癌疗法具有协同作用，还能显著减轻治疗相关毒性，从而改善患者的临床结果和生活质量[23]。

CTD是一种从Mylabris甲虫干燥体内提取的萜类化合物，主要通过抑制蛋白磷酸酶2A（PP2A）发挥强大的抗肿瘤作用[24]。这一机制通过损害恶性细胞中的蛋白质、RNA和DNA合成来破坏大分子生物合成[25,26]。我们之前的研究阐明了CTD在HCC治疗中的多靶点机制，包括调节自噬、转录调控、免疫反应动态和脂肪酸代谢重编程[27,28]。从机制上讲，我们证明CTD通过EZH2/H3K27me3依赖的细胞周期调控来调节转录程序[29,30]。此外，CTD通过去甲基化KDM4A依赖的组蛋白H3K36诱导基因毒性应激，导致DNA损伤积累[31]。值得注意的是，它通过EphB4介导的关键致癌途径（包括JAK2/STAT3和PI3K/Akt信号通路）的调节来抑制HCC进展[32]。这些发现共同证明了CTD作为一种多方面的治疗剂，在HCC管理中具有表观遗传、代谢和信号转导靶向特性。

近年来，几种含有CTD的中医制剂，如德力生注射液、艾迪注射液和丁二酸卡尼丁/维生素B₆注射液，在临床实践中被广泛用于通过多靶点调节不同的分子途径来治疗HCC[[33], [34], [35]]。然而，这些制剂中特定治疗靶点与生物活性成分之间的药效相互作用尚未完全阐明，特别是构成中医多药理学的协同机制。全面了解这些多组分协同网络对于充分发挥基于CTD的联合疗法的治疗潜力至关重要。

人参皂苷Rg3是最丰富和生物活性最强的人参皂苷之一，对包括HCC在内的多种癌症具有显著的预防和治疗效果[36]。越来越多的证据表明，Rg3通过调节关键致癌途径（如PTEN/Akt和PI3K/Akt/mTOR）来抑制肿瘤生长和转移[37,38]。值得注意的是，Rg3与其他治疗方式联合使用时具有协同作用。例如，它通过抑制糖酵解和PI3K/AKT通路来增强索拉非尼的抗HCC活性[39]。此外，将经导管动脉化疗（TACE）与Rg3联合使用可显著提高HCC患者的总体生存率[40]。Rg3还作为一种抗血管生成剂，增强了CTD在胰腺癌中的抗癌效果[41]。关键的是，Rg3通过涉及PI3K/AKT信号通路、Nrf2通路激活、SIRT1/AMPK刺激和ERK/JNK通路调节的机制，提供对化学诱导的肝脏损伤的保护[41,42]。因此，基于中医化合物的兼容性理论和已建立的研究基础，我们假设将CTD与Rg3结合使用可以增强CTD的抗HCC效果，同时减轻其固有的肝毒性。为了验证这一假设，我们研究了CTD/Rg3联合治疗的协同抗HCC效果，并阐明了其潜在的分子靶点和机制。

在这项研究中，我们探讨了CTD和Rg3联合治疗的协同抗HCC效果，重点关注它们对细胞增殖和转移潜力的影响。利用整合RNA测序（RNA-Seq）和网络药理学方法，我们阐明了这种联合疗法的潜在分子机制，并构建了一个包含相关分子靶点和信号通路的综合网络。我们的结果表明，CTD和Rg3协同调节HCC中的代谢重编程和免疫反应关键通路。我们还研究了识别出的枢纽基因与HCC微环境中肿瘤免疫浸润动态之间的关系。总体而言，这项工作为CTD/Rg3联合疗法的抗HCC效果提供了坚实的科学依据，并为其他中医衍生制剂的药效评估框架做出了贡献。

细胞培养和鉴定

使用两种不同的HCC细胞系评估了该药物组合的治疗效果，包括分化良好、转移较低的HepG2细胞系和高度转移的MHCC97-H变体，以涵盖广泛的生物学行为。这一互补的细胞系组合使我们能够全面研究HCC的侵袭性。在本研究中，人类HCC细胞系（HepG2和MHCC97-H）来自上海中桥新洲生物技术有限公司（中国上海）。

CTD和Rg3联合治疗在HCC中的协同抗肿瘤效果

为了评估Cantharidin（CTD）和Rg3的潜在协同抗HCC效果，我们首先确定了每种化合物的IC₅₀值。单独使用CTD（10.3 μM）或Rg3（106.1 μM）分别使HepG2细胞的存活率降低了约50%（图1A, B）。基于这些结果，我们在所有后续实验中选择了亚有效剂量（5 μM CTD和50 μM Rg3）进行联合治疗。此外，还使用Chou-Talalay方法进一步评估了CTD和Rg3之间的相互作用

讨论

HCC仍然是一个全球性的肿瘤学挑战，其特征是高发病率和死亡率[3,4]。中医，特别是联合草药疗法，已成为HCC管理的一种有前景的辅助策略，具有多靶点调节的优势[5,6]。CTD是一种来自Mylabris的生物活性成分，具有强大的抗HCC活性，但在临床应用中受到剂量依赖性毒性的限制[46]。基于中医的协同兼容性理论，本研究系统地评估了其疗效

CRediT作者贡献声明

苟向刚：可视化、方法学、正式分析、数据管理、概念化。周忠正：验证、正式分析、数据管理。王月华：软件、方法学、正式分析、数据管理。袁Henye：软件、研究。王子瑶：软件、资源。陈杰：可视化、软件、方法学。严伟：软件、资源、方法学。王海生：监督、资源、项目管理、资金获取。严佳：写作——审稿

伦理批准和参与同意

本研究遵循赫尔辛基宣言进行。所有动物实验均按照内蒙古医科大学生命科学学院实验动物伦理委员会的批准指南进行。内蒙古医科大学伦理委员会批准了本研究的动物实验。

我们的研究基于公共数据库TCGA和GEO中的开源数据。作为公共数据库，TCGA和GEO提供了患者数据

资助

本工作得到了内蒙古自然科学基金（2024MS08039, 2023MS08033）和内蒙古医科大学重点项目（YKD2022ZD009, YKD2025ZD005）的支持。

利益冲突声明

作者声明没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。

致谢

作者对所有参与这项研究的人表示衷心的感谢。