钠-钾-氯共转运蛋白1作为LPS诱导的肺部炎症中DAMPs介导的肺泡上皮细胞与巨噬细胞相互作用的新调控因子

《Biochemical Pharmacology》：Sodium–potassium–chloride cotransporter 1 as a novel regulator of DAMPs-mediated alveolar epithelial–macrophage crosstalk in LPS-induced lung inflammation

本研究探讨钠钾氯三重转运体1（NKCC1）在脂多糖（LPS）诱导的肺上皮细胞（AECs）与巨噬细胞相互作用中的作用。通过体外实验，使用A549细胞和RAW264.7巨噬细胞，发现LPS刺激AECs释放的损伤相关分子模式（DAMPs）如ATP、HMGB1和cGAS可激活巨噬细胞，促进炎症因子（TNF-α、IL-8）释放及吞噬作用增强。NKCC1抑制剂布美他尼预处理AECs或后处理巨噬细胞均显著抑制上述炎症反应（p<0.05），提示NKCC1调控DAMPs介导的AECs-巨噬细胞通讯，可能为脓毒症治疗提供新靶点。

　　

刘冠婷|谢宝春|吴耀光|黄国良|杨美晨|苏文琳|郭詹燕|兰周珍

台湾新北市佛教慈济医学基金会慈济医院研究部

摘要

败血症是一种危及生命的疾病，其特征是全身性炎症失控，巨噬细胞在此过程中起着关键作用，它们释放促炎细胞因子，加剧器官功能障碍和死亡率。当肺泡上皮细胞（AECs）受损时，会释放损伤相关分子模式（DAMPs），如细胞外三磷酸腺苷（ATP）、高迁移率族-box 1（HMGB1）和环状GMP–AMP合成酶（cGAS），这些物质进一步放大炎症级联反应并增强巨噬细胞的活化。钠-钾-氯共转运蛋白1（NKCC1）已被认为与急性肺损伤的发病机制有关，但其在AECs与巨噬细胞相互作用中的作用尚不明确。为了解决这一问题，我们使用了A549肺上皮细胞和RAW264.7小鼠巨噬细胞，在存在或不存在NKCC1抑制剂布美他尼的情况下用脂多糖（LPS）进行刺激。实验分为五组：对照组、单独使用布美他尼组、LPS-A549条件培养基组、布美他尼预处理组以及布美他尼后处理组。LPS刺激显著增加了A549细胞中的细胞外ATP、HMGB1和cGAS水平，而LPS-A549条件培养基则促使RAW264.7细胞上调晚期糖基化终产物受体P2RX7、Toll样受体2和4、细胞外信号调节激酶的磷酸化以及c-Jun N末端激酶的磷酸化，并产生白细胞介素-8和肿瘤坏死因子-α。同时观察到吞噬作用增强。重要的是，无论是A549细胞的预处理还是RAW264.7巨噬细胞的后处理，使用布美他尼都能显著抑制这些促炎反应（p < 0.05）。这些发现表明，LPS诱导的DAMPs从上皮细胞释放通过炎症信号通路驱动巨噬细胞活化，而NKCC1的抑制能有效抑制这些通路。本研究提示NKCC1可能作为DAMPs介导的AECs与巨噬细胞相互作用的调节因子。

引言

败血症是一种由病原体感染引发的严重疾病，会导致全身性炎症反应失控[1]。这种炎症级联反应可能导致严重的、甚至危及生命的器官功能障碍，从而引发败血性休克、多器官衰竭和死亡[2]。败血症是全球主要的健康威胁，其发病率正在上升。尽管医疗护理有所进步，但它仍然是全球主要的死亡原因之一，并对医疗系统造成重大影响[2]。即使有先进的治疗方法，败血症仍然是一个挑战。因此，进一步研究其潜在机制至关重要。

巨噬细胞在败血症的发病机制中起着核心作用，它们既影响炎症反应也影响组织损伤[3]。作为免疫系统的关键组成部分，巨噬细胞通过模式识别受体检测并响应入侵的病原体[4]。活化后，这些细胞会释放一系列促炎细胞因子，如TNF-α、IL-1β和IL-6，这些因子在启动和维持炎症反应中起着关键作用[5]。然而，巨噬细胞的过度活化会导致过度炎症，进而造成组织损伤和器官衰竭。巨噬细胞在防御病原体和潜在加剧组织损伤方面的双重作用使其成为败血症病理生理学的核心[6]。了解巨噬细胞的复杂功能对于开发调节败血症免疫反应的靶向疗法至关重要。

在败血症期间，肺泡上皮细胞（AECs）覆盖肺部，对气体交换至关重要[7]。败血症引起的炎症和损伤会破坏这些细胞，导致损伤相关分子模式（DAMPs）的释放，这些分子模式会放大局部炎症反应并扩展为全身性炎症[8]。炎症反应还会进一步损害肺泡-毛细血管屏障，导致通透性增加、肺水肿和气体交换受损[9]。因此，AECs在败血症及其相关呼吸系统并发症的病理学中起着重要作用。

钠-钾-氯共转运蛋白1（NKCC1）负责跨细胞膜转运钠、钾和氯离子[10]。这种转运蛋白对于维持细胞离子平衡和体积至关重要，并影响多种生理过程[10]。它在肺上皮细胞和巨噬细胞中表达[11]，特别是在调节肺部液体平衡方面尤为重要。NKCC1还与肺损伤有关，其表达水平升高会导致更严重的肺损伤[12],[13],[14]。了解NKCC1的功能和调节机制对于开发针对其失调相关疾病的靶向疗法非常重要。

鉴于肺泡上皮细胞和巨噬细胞在败血症诱导的炎症发生和传播中的关键作用，本研究旨在验证NKCC1在脂多糖（LPS）刺激下对它们相互作用的贡献。具体目标是确定NKCC1是否参与了受损肺泡上皮细胞与巨噬细胞之间的DAMPs介导的通信。我们假设NKCC1的活化通过上皮细胞来源的DAMPs放大巨噬细胞的炎症反应，从而加重局部肺损伤。相反，用布美他尼药理抑制NKCC1可以减弱这种促炎相互作用，为NKCC1作为调节败血症早期免疫反应的潜在治疗靶点提供机制上的见解。

实验流程

实验步骤

第一步：确认LPS诱导的DAMPs释放及在A549细胞中的剂量滴定

首先，将A549肺泡上皮细胞用不同浓度的LPS（0–200 μg/ml）处理16小时以生成条件培养基（LPS-A549 CM）。处理后，测量DAMPs的水平，如细胞外三磷酸腺苷（eATP）、高迁移率族-box 1（HMGB1）和环状GMP–AMP合成酶（cGAS）。该实验证实LPS刺激可诱导DAMPs的释放。

LPS对A549 CM中DAMPs产生的剂量滴定

图1显示了LPS对A549 CM中DAMPs产生的剂量滴定实验。实验流程图见图1A。将不同浓度的LPS（0–200 μg/ml）施用于A549细胞16小时。LPS处理后，DAMPs的水平（如图1B、1C和1D所示）显著增加（p < 0.05）。这证实了LPS刺激可诱导A549细胞释放DAMPs。

NKCC1抑制剂对LPS-A549 CM诱导的RAW264.7细胞中DAMPs产生的影响及布美他尼的剂量滴定

NKCC1抑制剂对LPS处理的A549细胞的影响

讨论

本研究有几个重要且新颖的发现。LPS可刺激肺上皮细胞（A549）释放多种DAMPs。LPS处理的A549细胞产生的条件培养基激活了巨噬细胞功能，增加了DAMPs、Pattern Recognition Receptors（PRRs）、吞噬活性和促炎细胞因子的产生。在A549细胞中预处理或后处理NKCC1抑制剂可减少DAMPs的产生，并进一步降低巨噬细胞的活化，包括吞噬作用和细胞因子的产生。

作者贡献声明

刘冠婷：撰写 – 原始草稿、研究、数据分析、概念构思。谢宝春：撰写 – 审稿与编辑、数据管理。吴耀光：资源获取、方法学设计。黄国良：数据管理。杨美晨：资源获取、项目协调。苏文琳：资源获取、项目协调。郭詹燕：资源获取、项目协调。兰周珍：撰写 – 审稿与编辑、项目协调、资金争取。

资助

本研究得到了国家科学技术委员会（MOST 111-2314-B-303-034）和台北慈济医院（TCRD-TPE-MOST-111-06和TCRD-TPE-111-RT-3(3/3)）的资助。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的研究工作。

致谢

本研究在台湾新北市佛教慈济医学基金会慈济医院研究部核心实验室进行。