氧化铁纳米颗粒驱动的线粒体更新能够恢复老化的骨髓微环境

《Biomaterials》：Iron Oxide Nanoparticles-Driven Mitochondrial Renewal Rejuvenates the Aged Bone Marrow Niche

通过工程化 konjac glucomannan-PEG-Fe3O4 纳米颗粒，激活供体巨噬细胞自噬并增强 Fe-S 簇生物合成，改善线粒体质量，促进 M2 极化巨噬细胞与衰老骨髓间充质干细胞（BMSCs）通过 connexin 43 紧密连接进行线粒体转移，恢复受体的膜电位、ATP 生成及钙稳态，从而提升骨修复效率。该策略突破单纯依赖转移量或极化的局限，建立可编程纳米平台实现组织再生。

　　

孙晓青|王星友|张美华|刘书瑶|朱月|何静|吴尧

四川大学生物材料国家工程研究中心，中国四川省成都市610064

摘要

随着人口老龄化，治疗与年龄相关的骨质疏松症仍然具有挑战性，因为衰老细胞的骨髓微环境功能失调，表现为慢性炎症、代谢紊乱和线粒体功能受损。虽然将巨噬细胞的线粒体转移到骨髓间充质干细胞（BMSCs）中是一个有前景的治疗途径，但其效果在老年环境中受到限制，因为供体线粒体存在功能缺陷且与受体的兼容性较差。我们设计了KGM-PEG-SPIONs，这是一种功能化的Fe₃O₄纳米颗粒，它通过激活自噬和Fe-S簇生物合成来提高供体线粒体的质量，促进M2型巨噬细胞的极化，并改善其与衰老BMSCs的氧化和炎症环境的兼容性。这些类似M2型的线粒体通过连接蛋白43间隙连接转移，恢复受体细胞的膜电位、ATP生成和钙稳态以及成骨分化。在老年骨质疏松模型中，KGM-PEG-SPION功能化的支架可以重塑免疫微环境并促进骨骼形成。通过将细胞器质量控制与环境适应性线粒体转移相结合，这种策略超越了仅关注转移数量或极化的方法，建立了一个基于细胞器的可编程纳米平台。

引言

随着全球人口老龄化趋势，与年龄相关的骨质疏松症和骨骼缺陷对再生医学提出了重大挑战[1]、[2]。在70岁以上的老年人中，骨折愈合时间比年轻人延迟40-60%，这主要是由于衰老骨髓微环境中的“免疫-代谢-干细胞”系统受到破坏。慢性低度炎症以及干细胞功能和代谢平衡的下降阻碍了有效的骨骼形成[3]、[4]、[5]。目前的治疗方法主要针对骨骼生长或炎症，但未能解决衰老骨髓微环境中的根本问题[6]、[7]、[8]。

线粒体是细胞生物能量代谢、氧化还原信号传导和先天免疫活性的核心调节器，因此对干细胞命运和组织稳态至关重要[9]。在衰老的骨髓间充质干细胞（S-BMSCs）中，线粒体膜电位下降60-70%，电子传递链（ETC）活性减弱，活性氧（ROS）的产生增加2-3倍，这些因素共同损害了细胞的生物能量代谢和成骨潜力[10]、[11]。

同时，最近的研究强调了“功能性线粒体细胞间转移”作为一种创新的细胞通讯机制，它促进了细胞间能量和代谢益处的传递。例如，巨噬细胞等供体细胞可以通过隧道纳米管、间隙连接或细胞外囊泡等途径将线粒体转移到骨髓间充质干细胞（BMSCs），从而恢复线粒体功能并增强其成骨能力[12]、[13]、[14]。然而，在老年动物中，这种策略的效果显著下降，因为受体S-BMSCs的线粒体摄取效率低于年轻对照组，这是由于代谢能力下降[15]。此外，巨噬细胞作为主要的线粒体供体，经常经历代谢耗竭和促炎性M1极化，严重影响了它们提供高功能完整性线粒体的能力[16]、[17]、[18]。与M1相关的炎症因子还会使微环境酸化并硬化，进一步阻碍了BMSCs对外源线粒体的整合[19]。仅仅增加转移频率不足以克服这些障碍，这表明供体线粒体的质量和微环境的兼容性是转移效果的重要因素[20]、[21]、[22]。

现有的基于材料的策略可以在一定程度上改善线粒体功能，例如使用CeO₂、MnO₂或富勒烯纳米颗粒来清除ROS并减轻受体的环境压力[23]、[24]、[25]，或者补充ATP前体（β-1,3-葡聚糖、肌酸、烟酰胺单核苷酸）来暂时“充电”供体细胞[26]、[27]、[28]。然而，这些方法通常忽略了上游的质量控制系统，包括铁硫（Fe-S）簇生物合成、线粒体自噬（线粒体吞噬）和金属辅因子的稳态。衰老巨噬细胞中的Fe-S簇（ETC复合物I-III和乌头酸酶的必需辅因子）不足，导致M1极化和生物能量代谢崩溃[29]、[30]。同时，自噬通路的缺陷会阻碍去极化线粒体的清除，产生功能失调的“准凋亡”供体，其转移能力几乎为零[31]。

基于这些见解，我们开发了一种“以线粒体质量为中心”的纳米工程策略，旨在重新激活巨噬细胞中的Fe-S簇生物合成和选择性线粒体吞噬，同时抑制细胞外ROS和炎症因子的产生，从而将内源性巨噬细胞重新编程为高能量的抗炎线粒体供体，并提高衰老BMSCs对转移线粒体的接受能力。超顺磁性氧化铁纳米颗粒（SPIONs）已被批准用作MRI造影剂和铁补充剂，具有过氧化物酶样的活性、磁响应性和多样的表面修饰潜力。然而，裸露的SPIONs容易聚集和氧化，从而失去其应有的性质，并引发Fenton诱导的氧化应激[32]、[33]、[34]。

为了解决这一挑战，我们设计了壳聚糖葡甘露聚糖-聚乙二醇功能化的Fe₃O₄纳米颗粒（KGM-PEG-SPIONs），它们可以协同促进Fe-S簇的再生，恢复线粒体自噬，并减轻炎症。这种双靶点方法既解决了供体线粒体质量差的问题，也解决了受体整合能力有限的问题，从而限制了老年骨骼的修复，代表了从数量驱动向质量驱动的线粒体治疗的转变，并建立了免疫介导的组织再生的材料-细胞协同范式。

部分内容摘录

衰老骨髓微环境中的自噬和代谢功能障碍

衰老是导致骨质疏松症等退行性骨病的主要风险因素，这是由衰老骨髓微环境中免疫细胞和BMSCs的分子失调引起的。为了探索这些与衰老相关的变化，我们从基因表达组学数据库（GEO）（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中获取并整合了骨质疏松症患者（OP）和健康对照组（N）的骨髓样本的转录组数据集（GSE100905、GSE160273，每组N=3，OP=3）（图1A和1G）。我们还

讨论

随着人口老龄化趋势的加速，骨质疏松症及其相关的骨骼缺陷已成为再生医学面临的重要挑战[38]。尽管在细胞移植、生物材料引导的骨形成和免疫调节方面取得了进展，但老年人“免疫-代谢-干细胞”轴的根本功能障碍仍然影响修复效果和持久性[39]、[40]。

为了解决这一未满足的需求，我们开发了KGM-PEG-SPIONs

结论

总之，我们的研究提出了一种以线粒体为中心的免疫代谢干预策略，旨在逆转衰老微环境中的骨骼再生失败。通过使用战略性设计的KGM-PEG-SPIONs，我们诱导衰老巨噬细胞发生自噬，从而上调DRP1和FUNDC1基因的表达，清除受损的线粒体。这一过程伴随着PGC-1α-NRF1-TFAM转录程序的激活，生成新的线粒体，从而促进

水溶性铁氧化物纳米颗粒（KGM-PEG-SPIONs）的制备

将三乙酰丙酮酸铁（0.706克，Sigma）加入到含有油酸（1.27克，Aldrich）、4-联苯羧酸（0.4克，Aldrich）和苯醚（10毫升，Aldrich）的溶液中。该溶液在室温下脱气1小时。随后，以20°C/分钟的速率将溶液加热至290°C，并进行剧烈磁力搅拌以防止聚集。反应混合物在该温度下保持30分钟。冷却后

CRediT作者贡献声明

王星友：可视化、软件、数据管理。孙晓青：撰写——初稿、研究、正式分析、概念构思。刘书瑶：软件。张美华：软件。朱月：资源。吴尧：撰写——审阅与编辑、监督、资源管理、项目协调、概念构思。何静：撰写——审阅与编辑、监督、项目协调、概念构思

利益冲突声明

? 作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（资助编号32271395, 32271397）、国家重点研发计划（资助编号2022YFC2406102）、四川省科技厅重大项目（资助编号2022ZDZX0029-1）以及贵州省基础研究计划（自然科学）（Qiankehe Basic-ZK[2022] General 513）的支持。