《Biomaterials》：Synergistic intercellular junction and anti-inflammation wound healing therapy via bioengineered hybrid nanovesicles
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慢性创面愈合过程中炎症调控与细胞间连接协同作用的研究。通过表面修饰DNA结构实现细胞间连接，利用DNA酶响应性释放调控炎症信号。同时负载中药活性成分Asiaticoside促进血管生成和细胞迁移。体外及体内实验均证实该生物工程纳米颗粒能有效加速愈合并抑制炎症反应。
张世一|何志英|周泽瑞|徐汉斌|郑世宇|刘新月|赵梦琪|陈斌斌|李大伟|钱若灿|田江伟
先进材料重点实验室，费林加诺贝尔奖科学家联合研究中心，精密化学国际联合实验室，物质生物学与动态化学前沿科学中心，华东理工大学化学与分子工程学院，中国上海200237
摘要
皮肤伤口愈合受损并伴有过度炎症的问题影响着全球数百万患者。由此产生的慢性疼痛会严重降低患者的生活质量。然而，由于伤口微环境的复杂性，皮肤伤口的治疗面临巨大挑战。本文报道了一种生物工程混合纳米囊泡（BHNVs）的设计，这种纳米囊泡通过同时提供有效的细胞间连接和炎症缓解来促进伤口愈合。混合纳米囊泡的表面经过修饰，外部具有拉链结构，内部含有DNA酶信号输出结构。从草药中提取的活性成分 Asiaticoside 以及信号识别 DNA 复合物被封装在纳米囊泡中。这些成分从外部和内部协同作用，从细胞外和细胞内两个方面促进伤口愈合。当囊泡与细胞融合时，外部的拉链结构有助于细胞间连接，而内部的 DNA 酶信号输出结构可以在监测炎症反应的同时抑制炎症。释放的 Asiaticoside 可以促进细胞增殖、增强血管生成、加速细胞迁移/粘附，并通过抗氧化和抗溃疡作用共同促进伤口愈合。实验和体内实验均表明，BHNVs 能够成功加速伤口愈合并预防炎症，显示出一种具有增强治疗效果的局部伤口管理方法。
引言
皮肤是覆盖人体表面的重要器官，可以直接与外部环境相互作用。皮肤能感知外部刺激、调节体温并保护身体免受外部损伤 [1]、[2]、[3]。然而，皮肤也是一种容易受伤的组织。持续性炎症导致的皮肤损伤是一种慢性疾病，影响着全球数百万患者，预计未来患皮肤伤口愈合障碍的患者数量将迅速增加 [4]、[5]、[6]。因此，慢性伤口愈合的治疗引起了研究人员和制药企业的广泛关注 [7]、[8]、[9]、[10]。
伤口愈合过程复杂且难以处理。在此过程中，真皮中的成纤维细胞群体会诱导胶原蛋白基质的沉积 [2]。角质形成细胞和成纤维细胞的增殖与迁移参与再上皮化 [11]。来自炎症细胞的多种机械和化学信号会触发细胞从伤口边缘迁移以填补缺口，直到伤口修复 [12]、[13]、[14]。此外，损伤后的炎症反应（包括血管生成增加 [15]、[16] 和巨噬细胞的表型变化）也参与伤口愈合 [17]。目前许多研究表明，过度的炎症反应是导致皮肤伤口愈合不良的原因，这会给患者带来严重不适并增加医疗成本 [14]、[18]、[19]、[20]。
已经开发出多种策略来促进皮肤伤口愈合，如胶原蛋白敷料、水凝胶覆盖物、微针等 [21]、[22]、[23]、[24]、[25]。然而，需要注意的是，由于伤口微环境的复杂性以及多种因素的影响，皮肤伤口愈合的治疗受到阻碍。因此，需要开发一种多功能方法，从细胞外和细胞内两个方面协同改善伤口愈合。基于这些考虑，我们旨在设计一种能够通过协调细胞外和细胞内治疗来增强伤口愈合的混合系统，从而提供细胞间连接和炎症缓解。
本文报道了一种用于促进伤口愈合并减少炎症的生物工程混合纳米囊泡（BHNVs）的设计（图 1）。BHNVs 的表面经过两种跨膜 DNA 功能结构的修饰，外部具有拉链结构，内部含有 Mn2+ 依赖的 DNA 酶信号输出结构（图 1A）。外部的拉链结构（Z1 和 Z2）相互配合以触发细胞间连接。S1 和 S2 中间的疏水性 C12 间隔物（C1 和 C2）用于膜锚定。内部的 DNA 酶结构（Dz1 和 Dz2）设计用于在 Mn2+ 存在时输出信号。同时，从药用植物 Centella asiatica 中提取的 Asiaticoside（As）和信号识别 DNA 复合物（DC1）被封装在纳米囊泡中 [26]。设计的 DC1 在 5’-端具有切割位点，将其分为两部分：较短的 miRNA-146a 互补靶区（R0）和较长的 DNA 酶底物序列（Ds0）。Ds0 可以被内部的 DNA 酶结构（Dz1 和 Dz2）识别并捕获，而 DNA 酶 5’-端标记的 FAM 的荧光会被 Ds0 中间标记的 BHQ1 灭活。在 Mn2+（参与 STING 通路的关键信号离子）[27]、[28] 存在的情况下，DNA 酶结构可以被激活以切割底物序列，从而释放 BHQ1 并使 FAM（标记在 Dz1 和 Dz2 的 5’-端）重新发光。另一方面，Ds0 3’-端标记的 Cy5 的荧光会被 R0 5’-端标记的 BHQ3 灭活。在 miRNA-146a（参与免疫和炎症反应的关键信号分子）[29] 存在的情况下，R0 可以被 miRNA-146a 替换，从而激活 Cy5 的荧光（图 S1）。如图 1B 所示，当囊泡与细胞融合时，外部的 DNA 结构通过互补杂交诱导细胞间连接，进一步促进成纤维细胞的增殖和生长。内部的 DNA 酶信号输出结构与 As 和信号识别 DNA 发夹结构共同调节细胞内炎症信号通路（图 1C）。BHNVs 递送到细胞后，As 可以促进细胞增殖、增强血管生成、加速细胞迁移/粘附，并通过抗氧化和抗溃疡作用共同促进伤口愈合 [30]。同时，内部的 DNA 酶信号输出结构有助于减弱炎症反应。
总体而言，这两种关键成分——DNA 功能结构和 Asiaticoside——协同作用，形成了一种有效的加速伤口愈合并抑制炎症的治疗策略。首先，我们通过划痕伤口实验验证了 BHNVs 的效果，发现外部的拉链结构有助于细胞间连接，而内部的 DNA 酶信号输出结构可以在监测炎症反应的同时抑制炎症。释放的 Asiaticoside 有助于促进细胞增殖、增强血管生成、加速细胞迁移/粘附，并促进伤口愈合。接下来，我们在小鼠模型中展示了 BHNVs 在加速伤口愈合和预防炎症方面的效果。我们的数据表明，BHNVs 在体外和体内均表现出良好的治疗效果。
小节片段
生物工程混合纳米囊泡的构建
本研究中使用的脂质体是根据先前的报告进行化学修饰后合成的。简而言之，使用二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）、二油酰磷脂酰胆碱（DOPC）和胆固醇以 1:1:2 的摩尔比制备了 5 mg/mL 的脂质体。通过旋转蒸发去除氯仿后，在小圆底烧瓶中得到一层薄膜。DNA 链在 37°C 下与 1× PBS 搅拌过夜。DNA 链可以通过
基于 DNA 功能结构和 Asiaticoside 的 BHNVs 设计
BHNVs 的合成过程如图 1A 所示。BHNVs 的脂质体由 1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱（DOPC）、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱（DPPC）和胆固醇按照先前报道的方法进行修饰 [32]。简要来说，将原料按 1:1:2 的摩尔比（DOPC、DPPC 和胆固醇）溶解在氯仿中，然后蒸发形成薄膜。选择薄膜水化法是因为其可靠性
结论
本文报道了一种由 DNA 结构和 Asiaticoside 构建的生物工程混合纳米囊泡（BHNVs），用于缓解皮肤表面伤口组织的炎症。与炎症细胞融合后，这种纳米囊泡可以将特定序列传递到细胞膜并进一步修饰两侧的跨膜 DNA。细胞膜外的 DNA 链通过互补配对促进炎症细胞之间的连接和通信
CRediT 作者贡献声明
陈斌斌：研究。赵梦琪：研究。田江伟：写作 – 审稿与编辑、监督、概念构思。李大伟：研究。徐汉斌：研究。周泽瑞：研究。刘新月：研究。郑世宇：研究。何志英：写作 – 原稿撰写、研究、数据分析、概念构思。张世一：写作 – 原稿撰写、研究、数据分析、概念构思。钱若灿：写作 – 审稿与编辑，
利益冲突声明
? 作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
本研究得到了国家自然科学基金（21977031、22176058）、上海市科学技术委员会（23ZR1416100）和学科人才引进计划（B16017）以及中央高校基本科研业务费（2632024TD05）的支持。作者感谢华东理工大学分析测试中心在样品表征方面的帮助。
