二维共价三嗪框架CTF-Ca通过调控钙调蛋白信号通路定向诱导间充质干细胞成骨分化

《Biomaterials》：Shaping Mesenchymal Stem Cell Fate with a Two-Dimensional Covalent Triazine Framework for Calmodulin Modulation

本研究开发了一种新型二维多孔共价三嗪框架材料CTF-Ca，该材料可在常温常压下合成，能够绕过细胞膜钙通道直接向细胞内递送钙离子，持续激活Ca2+/CaM信号通路。研究发现CTF-Ca不仅能显著增强间充质干细胞的成骨分化能力，还能在钙调蛋白功能抑制条件下恢复细胞的成骨潜能，并在C2C12成肌细胞中挽救肌管形成。该材料为直接调控细胞内钙信号提供了新工具，在再生医学领域具有重要应用前景。

　　

在干细胞研究与再生医学领域，精确调控细胞命运始终是一个核心挑战。钙离子（Ca²⁺）作为重要的第二信使，通过与其主要传感器钙调蛋白（Calmodulin, CaM）结合，在调控细胞增殖、分化和凋亡等过程中发挥关键作用。然而，直接调控细胞内CaM活性面临巨大困难，因为其活性与精细平衡的钙稳态紧密耦合，而传统的化学物质或生物材料难以靶向或接近这一目标。

在骨组织工程中，间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells, MSCs）的成骨分化对于骨再生至关重要。Ca²⁺/CaM信号通路通过激活下游效应分子如钙调磷酸酶（Calcineurin, CaN）和活化T细胞核因子（Nuclear Factor of Activated T-cells, NFAT），调控多种成骨相关基因的表达。但是，当细胞内钙稳态失衡或CaM功能受损时，这一过程会受到严重影响。目前，虽然离子载体（如A23187和离子霉素）或膜去极化方法能够短暂提高细胞内钙水平，但这些方法缺乏特异性且可能影响细胞活力，特别是在钙通道病等病理情况下，这些方法甚至可能无效且具有细胞毒性。

针对这一挑战，来自德国柏林自由大学的研究团队在《Biomaterials》上发表了一项创新性研究，他们开发了一种新型二维多孔共价三嗪框架材料CTF-Ca，为细胞内CaM调控提供了新策略。这种材料在常温条件下合成，无需额外热处理，具有温和、能量效率高的优点。

研究人员采用了多种关键技术方法开展本研究。他们通过催化剂-free的[2+2+2]环三聚反应合成CTF框架，并通过X射线光电子能谱（XPS）、能量色散X射线光谱（EDX）等技术表征了CTF-Ca的结构和钙负载情况。研究使用了人间充质干细胞（来自脂肪组织）、小鼠成肌细胞C2C12和大鼠心肌细胞H9C2等多种细胞模型，通过细胞活力检测、细胞内钙成像、分子生物学技术（如免疫荧光、Western blot、qPCR）等手段评估了材料的生物相容性和生物学效应。特别值得注意的是，研究还通过钙通道抑制剂钌红（Ruthenium Red）和无钙培养系统，验证了CTF-Ca的钙离子递送能力。

2.1. CTF-Ca的合成与表征

研究团队通过炔烃的[2+2+2]环三聚反应合成了异芳族共价三嗪框架（CTF）。¹³C固体态交叉极化魔角旋转核磁共振（CP-MAS NMR）分析显示，在110-140 ppm和155-175 ppm处的信号分别代表苯环和三嗪环的碳原子。原子力显微镜（AFM）、扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）表征显示CTF呈片层结构，横向尺寸可达数微米。冷冻电镜断层扫描显示CTF在溶液中呈现二维多孔结构，厚度约5纳米，表明存在少量堆叠层。将CTF与氯化钙混合后成功制备了CTF-Ca，XPS分析显示其钙含量为9.63 wt%，EDX mapping证实钙离子在框架中均匀分布。

2.2. 生物相容性和细胞摄取机制

CTF和CTF-Ca在浓度高达1000 ng/mL时对MSCs、C2C12和H9C2细胞均表现出良好生物相容性。细胞摄取实验表明，材料在4小时内即可进入细胞质，24小时后在核周区域积累。机理研究发现，CTF-Ca主要通过巨胞饮作用进入细胞，小窝蛋白介导的内吞也参与这一过程。

2.4. CTF-Ca在MSCs中介导钙内流

在钙通道抑制剂钌红存在条件下，CTF-Ca仍能提高MSCs内钙离子水平，维持钙振荡活动。在无钙培养系统中，CTF-Ca作为唯一钙源可向细胞内释放钙离子。这些结果表明CTF-Ca能绕过膜钙通道直接调节细胞内钙信号。

2.5. CTF-Ca激活MSCs中Ca²⁺-CaM相关信号通路

CTF-Ca处理24小时后，MSCs长宽比显著增加，呈现成骨分化倾向。成骨诱导7天后，CTF-Ca组早期成骨标志物Sox9和中期标志物Col1a1表达升高，碱性磷酸酶（ALP）活性增强。诱导14天和21天后，骨钙素（OCN）和骨涎蛋白（IBSP）等晚期成骨标志物表达也显著上调。机制上，CTF-Ca处理4小时和6小时后，激活的CaN水平显著升高，NFAT核转位增加，表明CTF-Ca通过Ca²⁺/CaN/NFAT信号通路促进成骨分化。

2.6. CTF-Ca补偿CaM抑制以维持MSC功能

使用CaM抑制剂W-7抑制CaM功能后，CTF-Ca处理能显著降低caspase-3/7活性，减少细胞凋亡。在W-7存在下，CTF-Ca仍能激活CaN并促进NFAT核转位。在低剂量W-7条件下进行成骨分化，CTF-Ca组Sox9和Col1a1表达仍高于对照组，表明CTF-Ca能部分补偿CaM抑制，维持MSCs的成骨潜能。

2.7. 在祖细胞中验证CTF-Ca介导的CaM抑制补偿作用

在C2C12成肌细胞中，CTF-Ca处理24小时增加CaMKII表达。分化5天后，CTF-Ca组形成更密集的肌管，核内生肌调节因子Myogenin表达升高，肌球蛋白重链（MHC）结构更完善。在W-7抑制条件下，CTF-Ca仍能促进肌管形成，挽救肌生成能力。

本研究成功开发了一种新型二维共价三嗪框架CTF-Ca，能够有效调节细胞内CaM活性。该材料能绕过细胞膜钙通道，直接向细胞内递送钙离子，激活Ca²⁺/CaM信号通路，促进MSCs成骨分化。更重要的是，在CaM功能抑制条件下，CTF-Ca能补偿CaM功能，维持细胞活力和分化能力。这一发现在骨骼肌祖细胞中也得到验证，表明CTF-Ca具有广谱应用潜力。

研究结果表明，CTF-Ca作为一种活性细胞内信号调节剂，而非单纯的钙离子载体，能够直接参与细胞信号网络调节。与传统的生物活性玻璃纳米颗粒或介孔二氧化硅纳米颗粒相比，CTF-Ca能直接调控细胞内钙信号机器，恢复CaM功能，这为设计能主动参与细胞信号通路的智能材料提供了新思路。

从转化视角看，CTF-Ca适合用于需要可控细胞内Ca²⁺/CaM调节的疾病建模和药物筛选应用，并可能作为功能材料组件用于依赖精确Ca²⁺/CaM信号调控的再生医学策略。尽管还需要进一步的体内研究评估其分散性、生物分布、免疫反应和长期稳定性，但CTF-Ca展示了材料从被动支架向主动信号调节转变的潜力，为设计能够精确控制细胞行为、分化和组织重塑的材料开辟了新可能性。