美国东部果园中果蝇及其周围环境中的微生物群组成

《Microbiology Resource Announcements》：Microbiota composition of fruit flies and their environments in eastern USA orchards

本研究分析东美国度梯度上果蝇及其果实和土壤环境的微生物组，发现样本类型、地理位置、基质来源和饥饿条件显著影响微生物组成。使用16S rRNA测序结合QIIME2分析，揭示不同果蝇种类（如D. simulans、D. melanogaster、D. suzukii）和环境间存在特异性菌群差异，并通过PERMANOVA和ANCOM验证了多个关键变量的显著性。

　　

摘要

我们通过对美国东部不同纬度地区收集的果蝇及其果实和土壤环境中的微生物群进行16S rRNA分析，研究了这些微生物群的组成变化。样本的差异受到果蝇分类、地理位置、采样基质和饥饿状态的影响。研究结果表明，微生物群组成随多个关键变量而变化。

公告

为了探讨果蝇微生物群组成与纬度之间的关系，我们在美国东部不同纬度地区收集并分析了果蝇及其环境样本中的微生物群。许多样本的相关数据已在另一篇专注于黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）的研究论文中报告（参考文献1）。本文则展示了在同一时间采集的样本中，不同果蝇分类单元间的微生物群差异。

2021年秋季，我们从美国东部的八个果园中收集了果蝇（详见参考文献1中的表S10）。我们采集了单个苹果或堆肥样本，以及相邻苹果果肉（1/4英寸×1/2英寸）和土壤（1/2英寸×3/4英寸）的样本。样本立即置于干冰上保存，或在一些情况下在室温下饥饿处理超过2小时后，再长期储存在-80°C环境中。通过显微镜检查单个雄性果蝇以确定其分类。黑腹果蝇（D. melanogaster）与模拟果蝇（D. simulans）可通过生殖器的形态差异进行区分；苏氏果蝇（D. suzukii）则依据翅膀的色素沉着模式进行鉴定；而Zaprionus属果蝇则通过其身体上的黑白条纹特征进行识别。我们还发现了一些可能属于Hydei果蝇（D. hydei）的样本，因其颜色较深且体型较大。每个样本被转移到96孔匀浆管中，使用Zymo Quick-DNA Fecal/Soil Microbe 96试剂盒（D6011）提取DNA。16S rRNA V4标记基因的测序采用了双重条形码技术（参考文献2）。PCR反应结果经过Just-a-Plate Normalization Kit（Charm Biotech, JN-120-10）进行标准化和合并（96个样本合并为一个样本池），随后使用Zymo gDNA Clean & Concentrator 11-302C进行浓缩。选取250至450 bp的DNA片段，在Sage Science Blue Pippin仪器上进行测序，并与其他样本一起在Illumina MiSeq平台上使用500循环v2化学体系进行测序。包括参考文献1中的样本在内，共有1010万个经过Illumina质量过滤的测序数据。在每个位置上，除四个样本外，其余样本的第一四分位数质量得分均大于30。

序列分析使用了QIIME2 2022.11软件（参考文献1-10）。除非另有说明，否则采用默认参数。在去除之前报告的291个样本后，最终保留了162个样本中的2,452,972个读段（见图1）。将属于Wolbachia的读段移除，以便分析果蝇的非生殖道微生物群。Bray-Curtis距离值随样本类型（土壤、苹果、果蝇）、采样地点、基质（苹果或堆肥）、果蝇种类、Wolbachia的存在情况（占比超过25%时计入）以及饥饿状态而变化。ACOM分析方法识别出在不同条件下差异显著的细菌属（见表1）。这些样本为了解野生果蝇和Zaprionus属果蝇的微生物群组成中与饮食和地理因素相关的变异提供了额外见解。

图1

图1 野生果蝇及其环境中的微生物群组成。每个样本的读段数量被压缩至153个，按属进行聚类，并根据元数据进行汇总。总体丰度低于2%的属被归入“其他”类别。

表1

表1 PERMANOVA和ACOM分析结果

CommensalibacterAcetobacter, Commensalibacter, Dysgonomonas, Gluconobacter, Komagataeibacter, PseudomonasAcetobacter, Commensalibacter, Corynebacterium, Dysgonomonas, Gluconobacter, Komagataeibacter, LeuconostocGluconobacter, Leuconostoc, Unusual Pasteurellales, Xanthomonadaceae, WeissellaAcetobacter, Commensalibacter, Dysgonomonas, Gluconobacter, Komagataeibacter, Unusual XanthomonadaceaeAcetobacter, Commensalibacter, Corynebacterium, Dysgonomonas, Gluconobacter, Komagataeibacter, LeuconostocUnusual PasteurellalesUnusual PasteurellalesWolbachia存在情况 Dysgonomonas

	自由度（df）	平方和（SS）	R2	F	P值	ACOM分析显示有差异的属
所有样本
样本类型（土壤、果实、果蝇）	2	2.66	0.04	4.34	0.001
地理位置	7	11.94	0.17	5.56	0.001
物种	4	2.81	0.04	2.29	0.001
苹果或堆肥	1	1.39	0.02	4.53	0.001
残差	167	51.18	0.73
总计	181	69.98	1
果蝇样本
地理位置	6	12.08	0.2	6.79	0.001
物种	4	2.71	0.04	2.29	0.001
苹果或堆肥	1	1.33	0.02	4.49	0.001
饥饿状态	1	0.23	0	0.76	0.73
1	0.58	0.01	1.97	0.02
残差	148	43.56	0.72
总计	161	60.48	1

致谢

本研究部分得到了美国国立卫生研究院下属的国家普通医学科学研究所（National Institute of General Medical Sciences）的支持，资助编号为R15GM140388。本文内容仅代表作者的观点，不一定反映美国国立卫生研究院的官方立场。