目前，已有超过140种基于抗体的疗法获得了美国食品药品监督管理局（US FDA）的批准，这些疗法为治疗包括视网膜退化在内的多种疾病提供了高度靶向和精确的方法。[1]、[2]、[3] 大多数抗体疗法是通过静脉或皮下途径系统给药；然而，它们的高摩尔质量限制了它们穿过生物屏障的渗透性，从而降低了在局部作用点的有效性。[4] 在眼科临床实践中，通常采用玻璃体内注射的方法，但这种方法作用时间较短，需要频繁给药以维持治疗浓度。反复的玻璃体内注射不仅不理想，还可能引发炎症、感染、眼压升高和患者不适等并发症。[5] 这些挑战凸显了需要持续递送抗体的策略，以减少注射次数并维持治疗浓度，从而提高整体治疗效果。
持续递送可以通过增加局部生物利用度来提高治疗效果，同时降低高抗体浓度带来的全身毒性。[4] 传统的持续释放策略通常依赖于将生物制剂封装在聚合物纳米颗粒中；然而，这种方法往往会使生物制剂在制备过程中暴露于恶劣的环境条件下，导致变性，从而影响其捕获效率和治疗效果。[6] 相比之下，水凝胶由于在水性条件下制备，可以保持生物制剂的结构完整性。[7]、[8]、[9]
基于亲和力的递送方法为从水凝胶中控制释放蛋白质治疗剂提供了一种有吸引力的方式。与传统主要依赖材料降解、网络交联或膨胀来调控释放的水凝胶系统不同，[10]、[11]、[12] 基于亲和力的系统利用亲和配体与目标蛋白质之间的非共价相互作用来实现持续且可调节的释放特性。[13]、[14] 第一代亲和系统借鉴了细胞外基质中的控制释放机制，特别是肝素与各种生长因子的天然结合。[15]、[16]、[17]、[18]、[19] 基于这些研究，最近的进展利用肽、适配体和蛋白质扩展了可以通过基于亲和力的系统有效释放的治疗蛋白范围，从而提高了特异性。[20]、[21]、[22]、[23] 例如，一种含有特异性神经生长因子-3结合肽的聚乙二醇（PEG）水凝胶已成功用于实现控制释放。[24] 尽管取得了这些进展，但目前用于控制抗体释放的基于亲和力的系统仍需要对抗体本身进行修改，或者依赖复杂的重组表达策略。[25]、[26] 因此，一种利用抗体天然结构相互作用的亲和系统为它们的持续递送提供了一种多功能的方法。
免疫球蛋白G（IgG）抗体由两个抗原结合片段（Fab）和一个片段可结晶结构域（Fc）组成，Fab通过识别和结合目标分子来发挥特异性，而Fc作为免疫效应功能和药代动力学的关键介质。[27] Fc结构域在抗体亚类中高度保守，通过激活补体或结合γ-Fc受体来介导细胞毒性效应功能。[28] 此外，Fc区域通过与新生儿Fc受体的相互作用延长了血清半衰期，使IgG能够在细胞内外运输。[29] 抗体通过高亲和力的非共价相互作用与人类IgG1结合（KD ～ 2 x 10-10 M），从而在100天内仅释放约20%的抗体，这凸显了这种相互作用的强度。[30]
在这里，我们介绍了一种基于亲和力的水凝胶平台，该平台利用特定的Fc肽配体（FcL）与基于抗体的治疗剂（KD ～ 1x10-8 M）之间的相互作用来实现它们的控制释放。通过靶向保守的Fc结构域，该系统无需进行化学修饰或重组工程。重要的是，由于FcL不会干扰抗体与其靶标的结合位点，因此这种方法应能通过Fc结构域的相互作用实现持续释放，同时保持Fab区域的生物活性。
基于柱层析中的亲和相互作用，我们探索了能够与IgG1的Fc结构域结合的合成短肽（HWRGWV[31]和(CFH)2KG[32]）以实现控制释放。这些短肽可以通过固相肽合成轻松制备，并且由于具有复杂的三级结构，比传统的IgG结合蛋白更稳定。[33] 这种方法利用Fc结构域与互补肽配体之间的内在结合亲和力，实现持续释放而不改变治疗分子的性质。
由于玻璃体主要由胶原纤维和透明质酸（HA）组成，[34] 我们将FcLs整合到一种基于HA的水凝胶中，该水凝胶采用了两种生物正交的点击化学方法：肟交联用于网络交联，逆电子需求Diels-Alder（IEDDA）化学用于独立固定FcL。这两种反应都在生理条件下进行，使该系统非常适合蛋白质递送。[35]、[36] 此外，HA-肟作为玻璃体的替代物具有生物相容性，因此我们对其用于玻璃体内注射充满信心。[37]
作为概念验证，我们共同递送了anti-sFRP2（一种针对分泌的frizzled相关蛋白2（sFRP2）的抗体）和Fc-Noggin（Noggin与人IgG1的Fc结构域的融合蛋白）。研究表明，anti-sFRP2和Fc-Noggin分别通过拮抗sFRP2和骨形态发生蛋白BMP2/BMP4来激活成年哺乳动物眼睛睫状上皮中的休眠视网膜干细胞（RSCs）。Wnt信号分子sFRP2以及BMP2/BMP4在体外抑制RSC增殖，并且在体内由角膜和晶状体分泌，因此它们在视网膜干细胞微环境中活跃存在。[38] 因此，在体内拮抗BMP2/BMP4（使用Fc-Noggin）和sFRP2（使用anti-sFRP2）可以刺激微环境中的RSC增殖。虽然激活RSC对于视网膜修复具有巨大潜力，但由于它们的稳定性有限，需要反复进行玻璃体内注射。
我们设计了一种持续释放的水凝胶制剂，利用其与Fc-Noggin和anti-sFRP2的Fc结构域之间的非共价相互作用，确保长时间的生物利用度，同时减少频繁给药的需要。我们使用了用FcL1-norbornene修饰的HA，并通过肟化学交联：HAT-ox-FcL1。我们证明了HAT-ox-FcL1在7天内单独和联合控制释放生物活性anti-sFRP2和Fc-Noggin，同时通过限制早期暴露于大量水中来保持蛋白质稳定性。这种基于亲和力的方法实现了这两种治疗剂在体内的局部释放，保持了它们的生物活性，与单次玻璃体内注射相比效果更好。此外，该系统有效消除了每天重复玻璃体内注射的需要，仅通过一次注射就实现了成年CD1小鼠眼睛中视网膜干细胞微环境的持续激活。
