《Carbohydrate Polymers》：Integrating heparan sulfate mimetics into LbL nanofilms as extracellular matrix-like architectures to promote bone tissue regeneration
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骨组织再生中基于RGTA?的层层组装技术（LbL）构建仿生骨外基质。体外实验表明，RGTA? OTR4120较OTR4131更显著促进前成骨细胞增殖及羟基磷灰石富集矿化，体内小鼠临界尺寸颅骨缺损修复实验证实其骨再生潜力。该方法通过聚赖氨酸介导的静电层层组装实现RGTA?稳定负载，为开发新型骨生物材料提供新策略。
E. Bullier-Marchandin|L. Rossignol|A. Echalard|S. Morin-Grognet|J. Maucotel|A. Arabo|D. Barritault|G. Ladam|B. Labat
鲁昂诺曼底大学，INSA鲁昂诺曼底分校，CNRS，PBS UMR 6270，F-27000，埃夫鲁，法国
摘要
为了提高生物材料在骨组织修复中的有效性，越来越需要仿生表面。层叠（LbL）技术因其多功能性和在温和条件下结合多种生物活性分子的能力而显得特别有吸引力。尽管已经开发了许多LbL系统，但那些整合了糖胺聚糖（GAG）的系统往往很快就会降解，这限制了它们在组织中的整合潜力。为了解决这一限制，我们研究了将ReGeneraTing Agents?（RGTA?）整合到LbL中的方法。RGTA?是肝素硫酸盐的糖苷酶抗性类似物，旨在保护和稳定生长因子。迄今为止，它们的使用仅限于可溶性配方或吸附在生物材料表面。在这里，我们提出了一种新的方法，将两种RGTA?（OTR4120和OTR4131）固定在LbL结构中，以产生类似骨细胞外基质的微环境。我们发现，与OTR4131相比，OTR4120在体外显著增强了骨形成作用，只有在OTR4120薄膜上才合成了成熟的富含羟基磷灰石的基质。随后的体内实验验证了OTR4120 LbL薄膜的成骨促进效果。这种新策略旨在结合OTR4120的再生潜力与LbL组装的结构和功能优势，为开发仿生成骨材料提供了新的途径。
引言
随着人口老龄化，修复受损组织的生物活性生物材料的需求变得越来越迫切。对于骨组织而言，已经开发了许多策略来改善、加速和维持骨再生。从21世纪初开始，仿生材料成为了研究的重点，由于新的制造工艺和技术的发展，制造出了能够模拟骨组织的智能医疗设备，取得了重大进展。从2D到3D方法，聚合物是一种高度多功能的材料，可以设计出复杂且可调节的形态。作为基质、膜或水凝胶，无论是合成的还是天然的，结合蛋白质、钙磷酸盐（CaP）甚至生长因子和细胞……，各种选择使它们具有非常广阔的应用前景。
骨基质的有机部分主要由胶原蛋白（主要是I型胶原蛋白）组成，但多糖的存在也具有重要意义，尽管数量较少。作为多糖家族的一员，硫酸化糖胺聚糖（GAG）无处不在。它们是大而无分支的阴离子多糖，由二糖亚单位通过共价键连接到核心蛋白上形成蛋白聚糖（PG）。已知它们可以结合并保护生长因子，如成纤维细胞生长因子2（FGF2）和骨形态发生蛋白（BMP），还可以防止细胞因子和趋化因子被蛋白酶降解（Dinoro等人，2019；Kisiel等人，2013）。在天然硫酸化GAG中，肝素硫酸盐（HS）由于其尿酸残基或葡萄糖胺上的硫酸化模式而具有高度异质性（Ravikumar等人，2020）。它们还可以被修饰以增强某些生物特性，因为作为细胞外基质（ECM）的结构成分，它们在细胞粘附、增殖和分化中起着关键作用。一篇最近的论文详细回顾了GAG修饰的主要化学策略（Uribe-Gomez等人，2025）。其他例子报道了肝素/肝素硫酸盐类似物的应用，如作为抗病毒剂（Hoffmann等人，2022；Ling等人，2025；Revuelta等人，2025；Singh等人，2025），或作为治疗多发性骨髓瘤和骨转移的有希望的试剂（Singh等人，2025），或者作为促血管生成的结合物（Revuelta等人，2025）。
在这种背景下，ReGeneraTing Agents（RGTA? - OTR3-SAS，法国巴黎）被开发出来。它们是多糖，是肝素硫酸盐的类似物，来源于合成葡聚糖聚合物，其亚单位通过α(1–6) C键连接，使其能够抵抗内糖苷酶的降解（Barritault, Gilbert-Sirieix等人，2017）。它们最初被设计用于替代受伤组织中的受损肝素硫酸盐。RGTA?已在多种组织中显示出再生特性（综述见Barritault, Desgranges等人，2017）。在RGTA?家族中，有两种分子引起了我们的注意，即OTR4120和OTR4131。它们具有相同的羧甲基和硫酸基团取代，取代程度分别为0.50和1.2（每个糖苷单位）（Papy-Garcia等人，2005）。唯一的化学区别是OTR4131中含有乙酰基。因此，RGTA?可以被视为设计类似骨细胞外基质结构的理想候选物。
考虑到这一点，高度多功能的层叠（LbL）技术（综述见Borges等人，2024）可以被采用。它允许逐步组装几乎任何聚离子成分或聚电解质（前提是它们带有相反的电荷），这些成分以自下而上的方式沉积在2D或3D生物材料的表面。根据沉积步骤的数量，可以构建从纳米到微米级别的多层结构，主要通过静电相互作用稳定，但其他弱键（氢键或疏水键）也可以提供帮助。这项技术的另一个主要优势是没有几何形状的限制。连续沉积可以精确地形成任何形状和任何表面拓扑结构，适用于长期植入物或可降解的支架。在仿生学方法中，虽然LbL组分的选取取决于它们的内在特性（生物化学和生物物理学），但额外的后处理可以扩大可能性范围，特别是精细调节机械性能。事实上，除了化学成分、拓扑结构和形状之外，细胞基质的硬度也非常重要。已经证明并且现在公认的是，细胞，特别是间充质干细胞（MSC），仅通过感知基质的硬度就可以改变其分化路径（Engler等人，2006）。在之前的基于GAG的LbL系统中，我们证明了genipin（GnP）是一种天然且生物相容的成分，它可以连接任何含氨基的分子（Gaudière等人，2014），适合交联并随后硬化含有软骨素硫酸盐A（CSA）的LbL薄膜，使其硬度与骨ECM相匹配，并最终在体外表现出成骨特性（Gaudière等人，2012；Labat等人，2016；Ozanne等人，2024；Roupie, Labat, Morin-Grognet, Echalard等人，2021）。
在本研究中，我们假设RGTA?可以整合到LbL薄膜中，以在骨生物材料表面构建类似骨细胞外基质的界面，从而促进骨形成。这种策略将为RGTA?在骨组织再生中的应用带来新的、先进的方法。在之前的工作中，直到最近的研究中，RGTA?要么作为水基配方注射到受损或受伤的组织中（Janssen等人，2023；Lee等人，2024），要么用作生物材料浸渍的溶液（Zapsalis等人，2025），甚至嫁接在支架上（Gansevoort等人，2025）。在这里，我们将带负电的OTR4120和OTR4131与带正电的多肽类似物聚-L-赖氨酸（PLL）结合，以设计强大的成骨LbL结构。我们首先证明了使用OTR4120和OTR4131构建LbL组装体的可能性。接下来，我们详细检查了它们的厚度、密度、化学性质、表面拓扑结构和硬度，然后进行了生物学评估。在首次体外实验中，我们测试并比较了含有OTR4120或OTR4131的两种LbL薄膜对MC3T3-E1前成骨细胞活性的影响。我们使用从RGTA?文献中选出的最佳浓度，用RGTA?溶液处理了嵌入LbL的RGTA?。我们确认，如果没有GnP硬化LbL薄膜，无论RGTA?的配方如何，细胞既无法粘附也无法增殖。相反，虽然OTR4131似乎促进了早期的成骨细胞分化，但OTR4120显著增强了后期的基质矿化。因此，我们选择OTR4120进行体内实验，使用涂有OTR4120-GnP LbL薄膜的Ti基植入物模型来填充小鼠的关键大小颅骨缺损。11周后，缺损几乎完全闭合，形成了成熟的矿化基质，因为其中含有大量的羟基磷灰石，这是天然骨组织的主要无机相。总之，在LbL薄膜中使用RGTA?-OTR4120为生物活性生物材料的表面功能化开辟了非常有前景的道路，使得能够开发出紧密复制细胞外基质特征的仿生涂层，并促进骨再生。
章节片段
RGTA?：OTR4120和OTR4131
再生剂RGTA?，OTR4120（批次#FS104）和OTR4131（批次#FS106）[约80 kDa]，来自OTR3-SAS（法国巴黎），是从葡聚糖T40衍生的GAG类似物。它们都含有硫酸基和羧甲基基团，使其成为肝素硫酸盐（HS）的类似物，由约247个糖苷单位通过α1–6键连接而成。OTR4120和OTR4131的主要区别在于OTR4131衍生物中额外的乙酰基（Papy-Garcia等人，2005；van Neck等人，2012）（
原位OTR4120和OTR4131 LbL纳米薄膜的组装
我们首先检查了使用这两种选定的OTR构建LbL薄膜的可能性（图3）。为此，我们使用QCM-D进行了PEI/(OTR4120/PLL)n和PEI/(OTR4131/PLL)n的逐步原位组装。第三归一化共振频率谐波Δf3/3的变化确认了每种OTR（?）和PLL（+）的连续沉积，两种OTR4120和OTR4131的频率降低趋势相似，这对应于水合质量的增加（图3）
结论
在这里，我们开发了一种基于HS类似物（RGTA?：OTR4120和OTR4131）的新薄ECM样基质，用于骨再生。这种仿生ECM是通过简单的LbL组装实现的，依次沉积OTR和类似肽的PLL。在genipin交联后，LbL薄膜在成骨前细胞上进行了测试。尽管早期细胞过程（粘附、形态和增殖）没有显示出明显差异
CRediT作者贡献声明
E. Bullier-Marchandin：撰写——原始草稿，软件，资源，方法学，研究。L. Rossignol：资源，方法学，研究。A. Echalard：资源，方法学，研究。S. Morin-Grognet：资源，方法学，研究。J. Maucotel：资源，方法学，研究。A. Arabo：资源。D. Barritault：撰写——审阅与编辑，资源。G. Ladam：撰写——审阅与编辑，可视化，验证，资源，项目管理，
未引用的参考文献
Akiyama, Raftery和Wharton, 2024
利益冲突声明
作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系：D. B.是RGTA?的共同发明者，也是OTR3的联合创始人、总裁和股东。OTR3公司对本研究中呈现的结果没有影响。代表所有其他作者，通讯作者（B. L.）声明他们没有任何财务利益、活动、关系或隶属关系
致谢
作者感谢Lucia Bertolini-Forno提供的技术支持，Pr Bohn和Pr Vera（亨利贝克勒尔癌症中心-鲁昂大学医院）提供微CT设备，以及Agnès Choppin和Franck Chiappini（OTR3）对论文的校对。作者衷心感谢évreux Portes de Normandie（EPN）、Normandie大区、法国国家科学研究中心（CNRS）和鲁昂诺曼底大学（URN）的财政支持。
