Annexin A5 通过 NRF2/ERK 通路调节 M2 巨噬细胞中的铁蛋白吞噬（ferritinophagy）和铁死亡（ferroptosis）机制，从而减轻免疫介导的肝脏损伤

《Cellular Signalling》：Annexin A5 ameliorates immune-mediated liver injury by regulating ferritinophagy–ferroptosis in M2 macrophages via the NRF2/ERK pathway

铁氧化物死亡调控机制及Annexin A5在免疫性肝损伤中的作用研究。采用激光共聚焦显微镜分析M2巨噬细胞铁氧化物死亡共定位，通过腺病毒转染mCherry-GFP-LC3B研究自噬体-溶酶体融合，利用siRNA和化学抑制剂/激动剂探讨NRF2-ERK1/2信号通路。结果显示Annexin A5通过抑制NRF2降解和ERK1/2磷酸化，减少自噬体-溶酶体融合，降低M2巨噬细胞铁氧化物死亡，促进肝细胞再生，为免疫性肝损伤治疗提供新靶点。

　　

李俊峰|钱子兵|李哲宇|毛晓荣|田爱萍|彭学斌|杨中霞|杨凯

兰州大学第一医院，中国兰州730000

摘要

背景与目的

M2型巨噬细胞是免疫介导的肝脏损伤的关键驱动因素。本研究的目的是探讨Annexin A5调节M2型巨噬细胞铁死亡（ferroptosis）的机制及其对免疫性肝脏损伤的保护作用。

方法

通过激光共聚焦显微镜分析了自身免疫性肝炎（AIH）患者和ConA诱导的免疫性肝脏损伤小鼠的M2型巨噬细胞中的铁死亡现象。通过mCherryGFP–LC3B腺病毒转染，研究了铁蛋白吞噬（ferritinophagy）和自噬体-溶酶体融合（autophagosomal–lysosomal fusion）对Annexin A5调节M2型巨噬细胞铁死亡的影响。利用si-RNA和核因子红系相关因子2（NRF2）及细胞外信号调节激酶（ERK）的激动剂，研究了M2型巨噬细胞的铁死亡过程。将骨髓来源的巨噬细胞极化为M2型巨噬细胞，用于细胞转移实验。建立了M2型巨噬细胞与肝细胞的共培养模型，以研究M2型巨噬细胞对肝脏再生的影响。

结果

M2型巨噬细胞在免疫介导的肝脏损伤中对铁死亡高度敏感，Annexin A5能有效抑制其铁死亡，从而对免疫介导的肝脏损伤具有保护作用。Annexin A5通过抑制NRF2的降解和ERK1/2的磷酸化，以及抑制自噬体-溶酶体融合来减轻铁蛋白吞噬作用，这增强了M2型巨噬细胞对铁死亡的抵抗力，并改善了免疫相关肝脏损伤的预后。此外，抑制M2型巨噬细胞的铁死亡还能促进肝细胞再生。

结论

我们的研究结果表明，Annexin A5对NRF2-ERK1/2信号通路的调节对于减轻免疫介导的肝脏损伤中的铁死亡至关重要。因此，靶向Annexin A5可能为治疗免疫介导的肝脏损伤提供新的治疗途径。

引言

免疫性肝脏损伤是一种由免疫反应介导的肝细胞损伤，是肝纤维化、肝硬化和肝癌进展的重要病理机制，其发病机制主要由免疫细胞（包括巨噬细胞）驱动[1]。免疫疗法有潜力推进免疫相关疾病的治疗[2]；因此，巨噬细胞的存活变得至关重要。

巨噬细胞是最重要的吞噬细胞和抗原呈递细胞，参与免疫防御、免疫自我稳定和免疫监视[3]。然而，关于巨噬细胞在免疫介导的肝脏损伤病理学中的作用存在争议。这种复杂性部分源于肝巨噬细胞的异质性，它们主要由肝驻留的库普弗细胞（Kupffer cells）和单核细胞衍生的浸润巨噬细胞组成。肝驻留的库普弗细胞在急性肝脏损伤期间显著减少，导致短暂的免疫紊乱，并影响后期肝功能的恢复[4]。此外，促进巨噬细胞凋亡以减少巨噬细胞数量是控制免疫介导的肝脏损伤的有效方法[5]。这些矛盾的结果可能与经典巨噬细胞（M1型）和选择性激活的巨噬细胞（M2型）之间的不平衡有关。值得注意的是，库普弗细胞和浸润巨噬细胞都可以根据微环境信号极化为M1型或M2型表型。M1型巨噬细胞的激活会产生促炎细胞因子和活性氧（ROS），而M2型巨噬细胞的激活会产生神经营养因子和抗炎细胞因子（如IL-10），从而产生抗炎作用[6]。目前大多数研究集中在通过调节巨噬细胞重编程或增加M2型巨噬细胞来改善肝脏损伤[7]。然而，关于免疫相关肝脏损伤中M2型细胞死亡的调控机制知之甚少。由于M1型和M2型巨噬细胞具有不同的抗氧化防御机制[8]，我们认为M1型和M2型巨噬细胞对氧化应激相关细胞死亡的敏感性差异可能导致这两种表型之间的不平衡，从而加剧免疫诱导的肝脏炎症。

铁死亡的发作与铁依赖性ROS的过量产生和脂质过氧化有关，这两种因素都会破坏细胞内的氧化还原平衡并引发细胞死亡[9,10]。核受体共激活因子4（NCOA4）是一种选择性货物受体，在铁蛋白吞噬过程中介导铁蛋白的自噬降解。考虑到铁蛋白吞噬在调节铁稳态中的作用，调节铁蛋白吞噬的流量会改变细胞对铁死亡的敏感性[11]。作为细胞对抗氧化应激的关键转录因子，NRF2在应激下转移到细胞核中，激活抗氧化基因的转录[12]。除了这一经典作用外，NRF2还与细胞铁死亡的调节密切相关[13,14]，并且可以诱导自噬的激活或抑制[15,16]。鉴于其启动这些多种下游通路的能力，我们研究了NRF2在免疫介导的肝脏损伤中的作用。

Annexin A5（A5）的分子量为36 kDa，属于annexin家族，以Ca²⁺依赖的方式结合到膜上[17]。A5具有独特的膜结合和自组装成有序二维阵列的特性，可以在膜损伤部位形成保护性屏障，促进膜修复[18]。当前研究中发现的最重要机制之一是A5能够结合磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine）。A5与PS的结合是其潜在的作用靶点，基于这一结合能力，从基础实验研究到II期临床试验已经开发出了多种凋亡成像探针[19]。研究表明，A5可以在创伤性脑损伤的小鼠中发挥神经保护作用，通过调节核转录因子κB（NF-KB）/高迁移率组B1（HMGB1）通路和NRF2/血红素加氧酶-1（HO-1）抗氧化系统来减轻神经元炎症、氧化应激和铁死亡[20]。另一项研究证实了A5在巨噬细胞从糖酵解向氧化磷酸化的代谢重编程中的主导作用，这诱导了M2型巨噬细胞的极化[7]。然而，A5在M2型巨噬细胞中诱导的铁死亡是否参与对抗免疫性肝脏损伤尚不清楚。

在这里，我们讨论了A5对ConA诱导的免疫性肝脏损伤中M2型巨噬细胞铁死亡的影响及其可能的机制。我们的结果显示，免疫介导的肝脏损伤中的巨噬细胞铁死亡是由铁蛋白吞噬介导的，而A5通过抑制自噬体-溶酶体融合来降低铁蛋白吞噬水平，从而增强M2型巨噬细胞对铁死亡的抵抗力。总之，这项研究的发现表明，进一步研究M2型巨噬细胞的铁死亡及其与自身免疫性肝病发病机制的关系可能会发现新的治疗机会。这些见解有助于加深对这些复杂肝脏疾病的理解和治疗。

部分内容

患者和样本

本研究使用了6名AIH患者的存档肝活检样本以及6名接受肝血管瘤切除术患者的肿瘤周围组织样本作为对照。AIH患者的肝活检组织均获取于患者首次诊断之前且未开始任何免疫抑制治疗之前。AIH的诊断依据欧洲肝脏疾病研究协会的指南进行[21]。所有

免疫相关肝脏损伤患者肝组织中M2型巨噬细胞的铁死亡增加

与对照组（血管瘤患者的肿瘤旁组织）相比，AIH患者表现出明显的肝脏炎症甚至肝细胞坏死（图1A-B）。此外，患者的肝组织炎症因子mRNA水平显著升高（图1C）。令人惊讶的是，我们最初发现肝组织中M1型和M2型巨噬细胞的特征因子CD86和CD163的mRNA水平也发生了变化（图1D）。因此，通过

讨论

在本研究中，我们证实了A5通过抑制M2型巨噬细胞中的铁蛋白吞噬来减轻免疫介导的肝脏损伤。我们首次证明，在免疫性肝脏损伤的小鼠模型中，抑制M2型巨噬细胞的铁死亡显著改善了预后。因此，我们确定了免疫介导的肝脏损伤的潜在治疗途径，并为免疫相关肝脏疾病的发病机制提供了新的见解。

肝脏

CRediT作者贡献声明

李俊峰：撰写——原始稿件、方法学、研究、概念化。钱子兵：撰写——原始稿件、方法学、研究、概念化。李哲宇：概念化。毛晓荣：撰写——原始稿件、方法学、研究、概念化。田爱萍：撰写——审稿与编辑。彭学斌：概念化。杨中霞：撰写——审稿与编辑。杨凯：撰写——审稿与编辑。

出版同意

不适用。

资助

本研究得到了以下机构的资助：国家自然科学基金（82360132）、甘肃省科技计划资金（24JRRA911、23JRRA1489）、甘肃省健康产业科技创新重大项目（GSWSZD2024–11）、兰州大学第一医院资金（ldyyyn2018–62、ldyyyn2020–02、ldyyyn2020–14）、甘肃省感染与肝脏疾病临床医学研究中心（21JR7RA392）、兰州科学技术

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。

致谢

不适用。