《Cellular Signalling》：Anti-fibrotic activity of nobiletin and nintedanib:
In vitro and
in vivo evidence in pulmonary fibrosis models
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肺纤维化是一种慢性进行性肺疾病，现有疗法效果有限。本研究发现nobiletin与nintedanib联用可抑制MRC-5细胞迁移及ECM沉积，促进凋亡和自噬，并通过调节表观遗传和PI3K-AKT-mTOR信号通路减轻胶原积累，为肺纤维化治疗提供新策略。
薛阳|王媛茹|李璐瑶|雷琪琪|向柳燕|张晓倩|刘杰|曹亚军|李慧芳|李学军
中国新疆石河子大学药学院/教育部新疆植物药资源与利用重点实验室，新疆石河子832003
摘要
背景
肺纤维化是一种众所周知的慢性进行性肺疾病，主要影响肺的间质组织，目前缺乏有效的治疗方法。诺贝林（Nobiletin）是一种多甲氧黄酮类化合物，具有BH3模拟剂的特性，主要从柑橘皮中提取，以其多样的药理活性而闻名。鉴于尼达尼布（Nintedanib）的临床试验结果不尽如人意，联合治疗可能是一种对抗肺纤维化的可行策略。
方法
通过用转化生长因子-β1（TGF-β1）诱导MRC-5细胞，建立了一个体外肺纤维化模型。通过伤口愈合和Transwell实验评估了诺贝林与尼达尼布联合使用对MRC-5细胞迁移的影响。利用免疫荧光和Western blot分析评估药物组合对纤维化相关标志物的影响，同时通过共免疫沉淀（Co-IP）实验评估其对自噬的影响。进一步使用C57BL/6J小鼠的博来霉素诱导的肺纤维化模型探讨了诺贝林和尼达尼布联合使用的抗纤维化效应及其潜在机制。
结果
体外实验中，诺贝林和尼达尼布的组合显著抑制了MRC-5细胞的迁移和细胞外基质沉积，同时促进了细胞凋亡和自噬。此外，这种组合通过调节表观遗传机制和PI3K-AKT-mTOR信号通路发挥了抗肺纤维化作用。体内研究进一步表明，诺贝林和尼达尼布的组合显著降低了小鼠的羟脯氨酸水平，减轻了肺部炎症，并有助于限制或防止胶原蛋白的积累。
结论
我们的研究表明，诺贝林和尼达尼布的组合在体外和体内均表现出良好的抗纤维化效果。
引言
在肺纤维化过程中，成纤维细胞分化为肌成纤维细胞，获得间充质特性，并促进细胞外基质（ECM）的积累。这些ECM的变化反过来直接影响成纤维细胞的增殖、迁移和分化。肺纤维化的病因是多因素的，包括恶劣的环境暴露、真菌和细菌感染以及特定药物等因素[1]。在早期阶段，肺纤维化可以通过标准化治疗得到有效控制。在中晚期，病情会迅速进展，导致高死亡率和生存时间显著缩短。确诊患者的平均生存期仅为2-4年[2]。
肺纤维化是一种众所周知的慢性进行性肺疾病，其发病机制非常复杂，涉及多种因素，如炎症反应、成纤维细胞的激活和增殖、细胞外基质的异常沉积和重塑以及表观遗传影响[3]。越来越多的证据表明，组蛋白去乙酰化酶（HDACs）在纤维化调节中起着关键作用。HDAC水平升高会驱动成纤维细胞分化为肌成纤维细胞[4]并通过多种途径加速纤维化。研究表明，抑制HDAC2可以减少TGF-β诱导的肌成纤维细胞分化[5]。HDAC1和HDAC2可以诱导组蛋白H3K9和H3K27的去乙酰化[6,7]。研究发现，在有丝分裂期间抑制HDAC2会增加前期的H3K9ac水平，而抑制HDAC3或SIRT1则会提高中期的H3K9ac水平[8]。组蛋白乙酰化可以放松染色质并激活抑制增殖和诱导凋亡的基因。SAHA是一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂，已被发现可以减少肝纤维化中的HDAC2、HDAC6和HDAC8的表达以及TGF-β1的信号转导[9]。HDAC抑制剂（HDACIs）已成为管理纤维化的潜在工具。
目前，肺纤维化的治疗选择包括肺移植和药物治疗。对于某些肺纤维化患者来说，肺移植是一个可行的选择，但手术方法面临重大挑战，如高昂的成本、供体不足和术后免疫排斥反应，这极大地限制了其临床应用[10]。在肺纤维化的临床管理中，糖皮质激素[11]和免疫抑制剂[12]（如环磷酰胺）仅推荐用于炎症驱动型亚型的短期缓解。然而，这些药物的长期使用会带来显著的不良反应，并且在包括特发性肺纤维化（IPF）在内的进行性纤维化疾病中疗效有限。相比之下，FDA已批准尼达尼布和吡非尼酮用于治疗IPF[13,14]。作为一种抗纤维化药物，尼达尼布是一种多靶点酪氨酸激酶抑制剂，可以抑制血小板衍生生长因子（PDGF）、血管内皮生长因子（VEGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）和表皮生长因子受体（EGFR）。这些靶点对肺纤维化具有良好的治疗效果[15]。作为多酪氨酸激酶抑制剂，尼达尼布可以抑制成纤维细胞的增殖、分化和胶原蛋白分泌[16]。尼达尼布在广泛的纤维化间质性肺疾病中表现出显著的延缓疾病进展的效果[17]。然而，这种药物并不能根治疾病，且存在明显的缺点，如不良反应。具体来说，它只能减缓肺功能的下降，而不能逆转已形成的肺组织瘢痕或实现完全治愈。此外，不良反应频繁发生，且部分患者的药物耐受性不佳[18]。因此，将尼达尼布与其他药物联合使用是治疗肺纤维化的合理策略。
诺贝林是一种从柑橘皮中提取的多甲氧黄酮类化合物，具有多种药理活性，包括抗炎、抗肿瘤和抗氧化应激作用，以及减少组织纤维化、降低血压和降低血脂和血糖水平的作用[19,20]。细胞凋亡是肺纤维化的重要机制[21]。TGF-β1是许多细胞（包括肌成纤维细胞）中自噬的调节因子[22]。早期研究表明，BH3模拟剂可以诱导自噬[23]。我们之前的研究发现，诺贝林具有BH3仅蛋白的药物特性，可以抑制BCL-2与BAX/BAK蛋白的结合，触发癌细胞的凋亡，并促进BCL-2与Beclin1的解离，释放自由的Beclin1以诱导自噬[24]。研究显示，诺贝林通过调节卵巢癌细胞中的ROS介导的自噬来促进凋亡[25]。此外，研究表明尼达尼布可以激活保护性自噬，从而导致恶性胸膜间皮瘤细胞的死亡[26]。鉴于诺贝林多样的药理活性，推测它在缓解肺纤维化方面具有巨大的治疗潜力。这种潜力可能通过调节多种信号通路来实现，为治疗这种疾病提供新的策略。
基于以上研究，目前尚未有关于诺贝林和尼达尼布联合治疗肺纤维化的报道。我们假设诺贝林和尼达尼布的组合可能比单独使用任何一种药物都具有更优的治疗效果。因此，本研究探讨了诺贝林与尼达尼布联合治疗肺纤维化的效果，并探索了这种组合的潜在机制，以便为新型肺纤维化疗法的临床进展提供有价值的见解。
材料与方法
本研究的动物实验获得了石河子大学第一附属医院实验动物伦理委员会的批准（A2020–139-01）。所有方法均按照相关指南和规定进行。作者遵守了ARRIVE指南。
诺贝林和尼达尼布的组合疗法抑制了TGF-β1诱导的MRC-5细胞的增殖和迁移
我们发现，诺贝林（30–80 μM）和尼达尼布（1–10 μM）均以浓度依赖的方式抑制细胞增殖。随后，我们将0.3 μM的尼达尼布与不同浓度的诺贝林结合，观察到30 μM的诺贝林加上0.3 μM的尼达尼布显著抑制了细胞增殖（图1A-C和补充图S1）。因此，我们选择了10 μM的诺贝林和0.3 μM的尼达尼布进行进一步实验，因为它们对MRC-5细胞没有明显的抑制作用
讨论
肺纤维化（PF）是一种致命的肺疾病，其发病机制复杂。受TGF-β驱动的活化成纤维细胞/肌成纤维细胞产生过多的ECM沉积，导致组织重塑和纤维化。炎症和免疫反应（涉及中性粒细胞和巨噬细胞）释放细胞因子和蛋白酶，加重肺部损伤。此外，异常的PI3K/AKT信号通路促进成纤维细胞的存活和增殖，最终导致不可逆的肺损伤。
目前的疗法包括
结论
总之，我们的研究揭示了一种新的治疗策略，即诺贝林和尼达尼布的组合。这种组合有效抑制了肌成纤维细胞的增殖、迁移和ECM沉积，同时诱导细胞凋亡。此外，诺贝林不仅增加了促凋亡蛋白BAX的表达，还通过结合BCL-2并释放Beclin1来促进Beclin1-BCL-2复合物的解离，从而促进自噬。
资助
本项目得到了国家自然科学基金（编号：82073878）的支持。
伦理批准和参与同意
本研究使用的程序遵循《赫尔辛基宣言》的原则。本研究的动物实验已获得石河子大学第一附属医院实验动物伦理委员会的批准（A2020–139-01）。
CRediT作者贡献声明
薛阳：撰写——初稿、验证、正式分析。王媛茹：方法学、研究。李璐瑶：验证、方法学。雷琪琪：软件、正式分析。向柳燕：软件、正式分析。张晓倩：资源准备。刘杰：数据管理。曹亚军：监督、数据管理。李慧芳：撰写——审阅与编辑、可视化。李学军：项目管理、资金获取。利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。
