《Environmental Pollution》：Characterization of insecticide resistance across aquatic arthropods of the California Sacramento River watershed
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水生无脊椎动物在Sacramento河流域对苯基吡唑和拟除虫菊酯类杀虫剂的抗性研究，通过分析rdl和vgsc基因发现Hyalella azteca存在抗性突变，而Chironomidae未检测到抗性，推测种群通过成虫迁入维持。
海伦·C·波因顿（Helen C. Poynton）| 伊琳娜·波卢尼娜-普鲁尔克斯（Irina Polunina-Proulx）| 塔琳·布罗哈尔（Taryn Broughal）| 以利亚·华莱士（Elijah Wallace）| 斯宾塞·卡迪根（Spencer Caddigan）| 俊娜·王（Junna Wang）| 莎伦·劳勒（Sharon Lawler）| 理查德·E·康农（Richard E. Connon）| 迈克尔·J·莱迪（Michael J. Lydy）
美国马萨诸塞大学波士顿分校环境学院，莫里西大道100号，波士顿，MA 02125
摘要
苯基吡唑类和拟除虫菊酯类杀虫剂在美国的水道中普遍存在，会对易受其高浓度影响的水生无脊椎动物群落造成危害，尤其是在降雨事件期间。在暴露程度较高的地区，非目标甲壳类动物Hyalella azteca已经进化出对拟除虫菊酯类杀虫剂的抗性，从而保护了其种群免于死亡。为了更好地了解美国加利福尼亚州萨克拉门托河流域无脊椎动物群落中的抗性情况，我们收集了水生节肢动物样本，以评估两个基因中的抗性突变：对狄氏剂（rdl）和电压门控钠通道（vgsc）的抗性，这两个基因是苯基吡唑类和拟除虫菊酯类杀虫剂的作用靶点。我们针对已知含有抗性突变的基因区域，获得了六个节肢动物目中rdl和vgsc的部分序列。在昆虫中的关键氨基酸（A301）和甲壳类动物中的S/G301处，RDL蛋白序列存在差异，这与昆虫对氟虫腈的抗性有关，这表明不同节肢动物目之间对氟虫腈的敏感性存在遗传差异。在初步测序的节肢动物中未发现抗性突变，随后我们在卡什沼泽（Cache Slough）的多个地点对rdl和vgsc序列进行了更全面的研究。正如先前所观察到的，H. azteca种群显示出对拟除虫菊酯的抗性，但尽管蚊蚋（Chironomidae）对氟虫腈高度敏感，却未检测到其对这两种杀虫剂的抗性。
引言
在过去三十年中，杀虫剂的使用从高毒性的鸟类和哺乳动物杀虫剂转向了毒性更高但对无脊椎动物毒性更强的杀虫剂（Schulz等人，2021年）。随着某些杀虫剂因害虫物种对其活性成分产生抗性而被禁用或效果减弱，“杀虫剂循环”（Connon等人，2019年）描述了这一变化趋势（Hawkins等人，2018年）。在过去二十年里，拟除虫菊酯类和苯基吡唑类杀虫剂的使用量有所增加。拟除虫菊酯类杀虫剂于20世纪70年代末上市，是来自菊花的有机除虫菊素的广谱合成衍生物。21世纪00年代，它们作为有机磷杀虫剂的替代品被广泛使用（Gajendiran和Abraham，2018年）。这些杀虫剂常用于农业、住宅区和蚊虫控制（Palmquist等人，2012年；Weston等人，2006年），导致它们在农村、城市和住宅区的水体中普遍存在（Huff Hartz等人，2019年；Stehle和Schulz，2015年；Weston等人，2005年）。苯基吡唑类杀虫剂是一类较新的杀虫剂，氟虫腈的商业生产始于1993年。除了农业和住宅用途外，氟虫腈还广泛用于兽医领域，如跳蚤项圈和洗发水（Simon-Delso等人，2015年）。这两类杀虫剂在水生环境中普遍存在（Norman等人，2020年；Stehle等人，2019年），并且在加利福尼亚州萨克拉门托河流域的暴风雨事件期间浓度和频率都很高（Weston等人，2019年）。
拟除虫菊酯类和苯基吡唑类杀虫剂因其对哺乳动物的低毒性而被广泛使用，这归因于它们在脊椎动物和无脊椎动物靶点基因上的分子差异（Buckingham等人，2005年；Dong等人，2014年）。拟除虫菊酯类杀虫剂作用于电压门控钠通道（VGSC），这是中枢神经系统中的关键钠通道。当拟除虫菊酯与该通道结合时，会抑制其失活，导致神经元持续放电、抽搐和死亡（Dong等人，2014年）。苯基吡唑类杀虫剂作用于γ-氨基丁酸（GABA）受体，也称为狄氏剂抗性（RDL）。RDL是一种配体门控的氯通道，在GABA神经递质结合时打开，参与快速抑制性神经传导。它是多种杀虫剂的作用靶点，包括环二烯类杀虫剂林丹和苯基吡唑类杀虫剂，这些杀虫剂会与氯通道结合并抑制其功能（Remnant等人，2014年）。已经在几种害虫的电压门控钠通道（vgsc和狄氏剂抗性（rdl）基因中记录了抗性突变。这些突变降低了杀虫剂与受体的结合亲和力，大大降低了其效力（Buckingham等人，2005年；Dong等人，2014年）。
由于拟除虫菊酯类和苯基吡唑类杀虫剂都是广谱杀虫剂，它们会影响非目标节肢动物，因为RDL和VGSC在昆虫和其他节肢动物物种中高度保守。通过农业和城市径流，这些杀虫剂在水生环境中广泛存在，并有可能严重影响大型无脊椎动物群落（Norman等人，2020年；Stehle等人，2019年；Stehle和Schulz，2015年；Weston等人，2014年；Weston和Lydy，2014年）。事实上，中型生态系统研究证实，环境相关的杀虫剂浓度会影响水生无脊椎动物群落，导致种群数量和物种丰富度下降（Hasenbein等人，2016年；Miller等人，2020年；Wieczorek等人，2018年）。
Hyalella azteca是一种分布于北美和中美洲的水生端足类动物，对杀虫剂具有高度敏感性。先前的研究发现，H. azteca在加利福尼亚州的农业和城市地区以及新英格兰的住宅区已经进化出对拟除虫菊酯类和有机磷杀虫剂的抗性（Major等人，2018年，2020年；Weston等人，2013年），在杀虫剂浓度极高时（如暴风雨事件期间）可以防止当地种群灭绝（Weston等人，2019年）。虽然抗性的进化使H. azteca能够在有毒环境中生存，但这些适应性特征会带来适应性代价（Heim等人，2018年），并且抗性的H. azteca会促进杀虫剂向鱼类捕食者的传递（Johanif等人，2021年；Muggelberg等人，2017年）。多项研究分析了萨克拉门托河流域内的杀虫剂浓度和H. azteca的抗性，表明该地区受到拟除虫菊酯类和苯基吡唑类杀虫剂的严重影响（Fuller等人，2022年；Major等人，2018年；Weston等人，2005年，2019年）；然而，这些杀虫剂对大型无脊椎动物群落的影响以及其他节肢动物物种是否也进化出抗性尚未得到探讨。
在这项研究中，我们调查了萨克拉门托河流域内的其他节肢动物物种是否也进化出了对拟除虫菊酯类或苯基吡唑类杀虫剂的抗性。我们在萨克拉门托河和卡什沼泽（Cache Slough）复合体中收集了水生无脊椎动物样本，这里是濒危鱼类Hypomesus transpacificus和其他需要保护的鱼类物种的重要栖息地。我们对七个节肢动物目的VGSC和RDL的杀虫剂抗性靶点区域进行了测序，以确定当地无脊椎动物是否对这些杀虫剂类别产生了抗性。最后，我们对卡什沼泽复合体中的蚊蚋科（Chironomidae）和Hyalellidae种群进行了测序，以确定这些重要无脊椎动物家族中的抗性突变频率。
节选
无脊椎动物的采集、保存和鉴定
研究地点包括卡什沼泽、萨克拉门托河和俄罗斯河（表1），这些地点的选择基于先前的研究，这些研究表明这些地点的水中存在拟除虫菊酯类、氟虫腈及其降解产物（Uychutin等人，2024年；Weston等人，2019年）、被动采样器（Fuller等人，2022年）以及无脊椎动物（Anzalone等人，2022年）。无脊椎动物样本主要来自与卡什沼泽复合体相关的地点，尤其是Weston等人2019年采样过的地点附近。
大型无脊椎动物的采集和鉴定
收集的无脊椎动物信息见表1和S2。卡什沼泽复合体中的大多数地点缺乏支持多样化大型无脊椎动物群落的微生境，如岩石和水生植被。这些样本主要由静水生态系统中的典型物种组成，包括浮游动物、端足类、环节动物和适应静水的昆虫。昆虫主要来自双翅目（Diptera）、蜻蜓目（Odonata）和半翅目（Hemiptera）。昆虫的丰富度和数量相对讨论
在本研究中，我们从萨克拉门托河和卡什沼泽复合体中收集了大型无脊椎动物，这些水域受到农业和住宅用途产生的大量杀虫剂的影响（Weston等人，2019年），以确定非目标大型无脊椎动物物种中是否普遍存在进化出的杀虫剂抗性。我们成功克隆了这两种水体中最常见的两种杀虫剂类别——拟除虫菊酯类和苯基吡唑类杀虫剂的靶点基因vgsc和rdl的片段。
结论
在本研究中，我们在加利福尼亚州经历高拟除虫菊酯类和苯基吡唑类杀虫剂暴露的地区收集了节肢动物。从这些地区收集的H. azteca通常表现出对拟除虫菊酯的抗性，这是由于vgsc基因的突变所致。我们成功克隆并测序了七种不同节肢动物目的拟除虫菊酯类杀虫剂的靶点基因vgsc和苯基吡唑类杀虫剂的靶点基因rdl，并检查了这些序列中是否存在抗性突变。
CRediT作者贡献声明
以利亚·华莱士（Elijah Wallace）：方法学、调查。伊琳娜·波卢尼娜-普鲁尔克斯（Irina Polunina-Proulx）：写作——审阅与编辑、可视化、方法学、调查。塔琳·布罗哈尔（Taryn Broughal）：方法学、调查。海伦·C·波因顿（Helen C Poynton）：写作——审阅与编辑、初稿撰写、可视化、调查、资金获取、概念化。迈克尔·J·莱迪（Michael J. Lydy）：写作——审阅与编辑、资金获取、概念化。莎伦·劳勒（Sharon Lawler）：写作——审阅与编辑、调查。理查德·E·康农（Richard E. Connon）：写作——
资金来源
本研究得到了美国国家科学基金会（National Science Foundation）的资助，项目编号为1950074，以及加利福尼亚鱼类和野生动物部门（California Fish and Wildlife）的Q2096001号拨款。
利益冲突声明
? 作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
我们感谢Sara Anzalone和Neil Fuller提供了来自萨克拉门托河的样本。
