《Fish & Shellfish Immunology》：Recombinant phage-display monoclonal antibody against starry flounder (
Platichthys stellatus) IgM enables quantitative ELISA for vaccine-induced humoral responses
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定量评估鱼类疫苗免疫应答的关键在于开发物种特异性抗体工具。本研究通过重组噬菌体展示技术成功研制出星斑鮸IgM单克隆抗体1T1A11，并构建了高灵敏度的间接ELISA检测体系，实现了血清IgM的剂量-时间动态监测，为鱼类疫苗效果评估和诊断提供标准化工具。
孙敏英（Min-Young Sohn）| 平岛纯一（Jun-ichi Hikima）| 姜京植（Gyoungsik Kang）| 金京镐（Kyung-Ho Kim）| 孙哈贞（Ha-Jeong Son）| 朴昌一（Chan-Il Park）
韩国庆尚国立大学海洋科学学院海洋生物学与水产养殖系，455，统营市，650-160
摘要
对于许多水产养殖物种来说，与其物种相匹配的血清学试剂非常稀缺，这限制了对疫苗反应的定量评估。在这里，我们使用重组噬菌体展示技术开发并验证了针对星斑比目鱼（Platichthys stellatus）免疫球蛋白M（IgM）的单克隆抗体（MAbs）。从免疫血清中纯化的IgM被用作生物筛选的抗原，产生了多个IgM反应性的scFv候选物，所有这些候选物通过Western blot分析都能识别IgM重链。其中一个主要克隆（1T1A11）被重新构建成scFv-Fc迷你抗体，在哺乳动物细胞中表达，通过蛋白质A亲和层析纯化，并确认其具有预期的分子大小。1T1A11迷你抗体能够特异性地从纯化的样品和血清中沉淀IgM，从而证实了其功能特异性。利用这种单克隆抗体，我们建立了一种优化的间接ELISA方法，用于定量监测接种Streptococcus parauberis福尔马林灭活细胞后的体液免疫反应。该检测方法显示血清中的IgM水平随剂量和时间的增加而明显上升，这些变化进一步通过星斑比目鱼IgM的标准曲线进行了量化。总体而言，这些结果证明1T1A11是一种特定且可扩展的试剂，能够用于比目鱼水产养殖中的标准化、定量血清学分析和诊断应用。
引言
水产养殖疾病在全球范围内造成了巨大的经济损失，这突显了有效预防和免疫管理策略的迫切需求。鱼的免疫系统包括先天性和适应性成分，共同抵御各种病原体[1]，[2]。其中，由免疫球蛋白（Igs）介导的体液免疫反应在识别和中和入侵病原体方面起着核心作用。
在各种免疫测定方法中，酶联免疫吸附测定（ELISA）被广泛用于检测血清中的特异性抗体。在陆地动物中，由于其高灵敏度、特异性和成本效益，ELISA已被广泛用于识别感染史、评估疫苗效果和监测免疫健康状况[3]。在哺乳动物中，抗体主要由免疫球蛋白A（IgA）、IgD、IgE、IgG和IgM组成，其中IgM是在抗原暴露后首先产生的同种型，随后产生IgG，后者介导持久且高亲和力的免疫反应[3]，[4]。
相比之下，硬骨鱼类具有三种主要的免疫球蛋白类别——IgM、IgD和IgT/IgZ。在这些免疫球蛋白中，IgM是血清和黏液中的主要成分，具有中和病原体、介导抗体依赖性细胞毒性和激活补体系统的功能[5]，[6]。尽管鱼类IgM的亲和力和结构多样性相对较低，但硬骨鱼类在暴露于病原体后仍能产生抗原特异性抗体[7]，[8]，[9]，[10]。因此，基于抗体的检测方法已被应用于识别未感染的亲鱼群体和评估水产养殖物种中的疫苗诱导的抗体反应[8]，[11]，[12]，[13]。
由于鱼类的抗体反应受到物种、环境和生理因素的影响，因此需要开发能够识别鱼类免疫球蛋白M（IgM）的物种特异性次级抗体。然而，对于非模式鱼类（如星斑比目鱼Platichthys stellatus）来说，可用的免疫学工具很少，这限制了血清学和免疫学研究。据我们所知，目前还没有报道过专门识别星斑比目鱼IgM的单克隆抗体。
因此，本研究旨在开发针对星斑比目鱼IgM的单克隆抗体（MAbs），并建立一种可靠的ELISA系统用于抗体检测。为此，我们纯化了星斑比目鱼IgM，并对其天然抗原进行了噬菌体展示选择，随后通过ELISA、Western blotting和免疫沉淀来验证其特异性和检测兼容性。所得到的重组scFv-Fc迷你抗体格式支持蛋白质A纯化和易于标记，不仅适用于间接ELISA，还适用于捕获ELISA、天然IgM的免疫沉淀（IP）以及潜在的免疫组化/流式细胞术（IHC/flow）应用。总体而言，本研究提供了一种物种特异性的IgM单克隆抗体，有助于可靠地监测疫苗反应、亲鱼群体筛选以及未来比目鱼水产养殖的诊断试剂盒开发。
实验部分片段
伦理声明
所有涉及动物的实验程序均遵循韩国庆尚国立大学（GNU）动物护理和使用委员会的指南进行。实验方案经过了庆尚国立大学海洋科学学院研究伦理委员会的审查和批准（批准代码：GNU-241104-E0206；批准日期：2024年11月4日）。
从星斑比目鱼中分离血清
血清样本来自接种了Streptococcus parauberis的星斑比目鱼
星斑比目鱼IgM的纯化
通过SDS–PAGE在还原和非还原条件下检测了星斑比目鱼IgM的纯度（图1）。
在非还原条件下（第2条泳道），完整的IgM未能完全迁移到凝胶中，因此没有形成明显的条带，这与硬骨鱼类IgM的高分子量多聚体结构一致。
相比之下，在还原条件下（第3条泳道），检测到了与μ重链（约70 kDa）和轻链（约25 kDa）相对应的清晰条带，从而证实了...
讨论
在本研究中，通过重组噬菌体展示技术成功开发并验证了针对星斑比目鱼IgM的单克隆抗体（MAbs）。传统的杂交瘤方法长期以来一直用于生产诸如橄榄比目鱼（Paralichthys olivaceus）和太平洋鲱鱼（Clupea pallasii）等物种的单克隆抗体[14]，[15]。然而，由于鱼类淋巴细胞的融合效率低以及骨髓瘤生成受限，杂交瘤的生成往往受到阻碍...
作者贡献
· 孙敏英（Min-Young Sohn）：数据整理、正式分析、研究、软件处理、数据可视化及原文撰写
· 平岛纯一（Jun-ichi Hikima）：正式分析及研究
· 姜京植（Gyoungsik Kang）：数据整理及正式分析
· 金京镐（Kyung-Ho Kim）：数据整理及正式分析
· 孙哈贞（Ha-Jeong Son）：研究及软件处理
· 朴昌一（Chan-Il Park）：概念构思、项目管理、数据可视化、监督及原文撰写及审稿编辑
致谢
本工作得到了韩国政府（MSIT）资助的韩国国家研究基金会（NRF）（项目编号：RS-2024-00345227）的支持。
