《Food Hydrocolloids》：Structural modification and functional improvement of pea protein isolate by covalent grafting with EGCG induced by electron beam irradiation
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本研究通过电子束辐照将EGCG共价键接合至豌豆蛋白 isolate（PPI），证实其能改变PPI二级及三级结构，提升溶氧性、抗氧化性、热稳定性和乳化性能，并增强15天储存稳定性。
杨娜娜|李慧玲|李奎|尚关瑞宇|牛伟|江天|雷宏杰
中国西北农林科技大学食品科学与工程学院，杨陵，712100
摘要
本研究旨在探讨利用电子束辐照（EBI）诱导茶多酚（EGCG）与豌豆蛋白分离物（PPI）共价接枝的可行性。随后，评估了共价接合物（PPI-EGCG）的结构和功能特性。游离氨基、游离-SH基团和游离色氨酸含量的减少，以及EGCG结合当量的增加，均证实了EGCG的成功接枝。多光谱分析显示，EGCG的接枝导致PPI结构展开，从有序结构转变为更灵活的结构，其内部的疏水基团暴露在更极性的环境中。EGCG与疏水基团的共价接枝降低了PPI的表面疏水性。这些结构变化提高了其溶解性、抗氧化活性和热稳定性，并通过皮尔逊相关性分析得到了验证。此外，EGCG作为交联剂所具有的强空间稳定作用可能解释了PPI-EGCG乳液在储存15天后的更高稳定性。这些结果表明，EBI是一种绿色且高效的技术，可用于促进多酚与蛋白质的共价接枝，为增强PPI的功能特性提供了创新方法。
引言
世界人口的持续增长对全球蛋白质需求提出了持续挑战，同时人们对蛋白质营养不良和必需氨基酸不平衡的问题也越来越关注（Kim等人，2024年；Zha等人，2019年）。由于植物蛋白具有健康益处、可持续性和环境友好性，因此在食品和制药行业中受到了广泛关注（Li、Han等人，2024年）。植物蛋白的较低成本也有望提高其在这些领域的可负担性和经济可及性（Hota等人，2025年）。此外，素食者和乳糖不耐受者对具有多种健康益处的植物蛋白有大量需求（Huang等人，2023年）。植物蛋白被认为是一种功能性添加剂，能够发挥多种作用，如稳定乳液和泡沫、作为抗氧化剂以及作为凝胶剂。豆类蛋白是最常用的蛋白质之一，因为它们易于提取且蛋白质含量高（Hota等人，2025年）。豌豆蛋白分离物（PPI）是从豌豆中提取的植物蛋白，由于其广泛的可用性、低过敏性和平衡的氨基酸组成以及非转基因特性，在全球植物蛋白市场中越来越受欢迎（Dai等人，2020年；Hao等人，2022年；Zhang等人，2022a年）。然而，PPI的固有分子结构及加工过程中的外部因素共同导致了其溶解性较差，从而限制了其在食品生产中的广泛应用。PPI中丰富的球蛋白（70%–80%）使其蛋白质结构紧凑且柔韧性降低，从而导致溶解性下降和功能特性受限（Jiang等人，2022年）。此外，在PPI的提取和纯化过程中发生的变性和聚集进一步加剧了溶解性的降低，限制了其起泡、乳化和消化性能（Kim等人，2024年；Zha等人，2019年）。因此，在食品应用之前需要对其进行处理以增强其功能特性。
多酚与蛋白质的复合引起了广泛关注，因为它们可以改善蛋白质的结构和功能特性。多酚是植物来源的次级代谢产物，可以通过非共价或共价相互作用与蛋白质结合，从而增强蛋白质的功能特性。蛋白质与多酚之间的相互作用在食品加工和储存过程中也很常见（Huang等人，2023年；Liu、Tang等人，2024年）。研究人员已经证明，蛋白质-多酚接合物具有更好的溶解性、抗氧化活性、热稳定性和乳化能力。Zhang等人（2023年）发现，在中性和弱酸性条件下，乳清蛋白与EGCG（WP-EGCG）之间的非共价相互作用增强了抗氧化活性。同时，蛋白质的重排暴露了更多的疏水基团，从而改善了乳化性能。Liu、Chen等人（2024年）还指出，乳铁蛋白和茶黄素通过疏水相互作用和氢键形成了非共价复合物（LaF-TF），改变了LaF的二级结构并暴露了内部的疏水氨基酸残基。形成的LaF-TF表现出增强的抗氧化活性和乳化能力，同时降低了油水界面张力和表观粘度。然而，与非共价接枝相比，共价结合可以诱导更显著的蛋白质结构重排，从而对蛋白质功能产生更明显的影响（Kim等人，2024年）。此外，由于共价接枝形成的共价键是不可逆的、更稳定的且持久的，因此蛋白质与多酚之间的相互作用更为牢固，使其成为食品应用的首选（Liu等人，2025年）。Dai等人（2023年）证实，与SPI-茶多酚的非共价复合物相比，共价接合物表现出增强的功能特性和茶多酚的生物利用度。Ke等人（2023年）也表明，槲皮素的共价接枝显著提高了酪蛋白的溶解性，而非共价结合则降低了溶解性。这些结果都表明，多酚复合，特别是共价结合，可以显著改善蛋白质的功能特性，从而扩展其在食品工业中的应用。然而，传统的蛋白质-多酚共价复合方法是通过自由基诱导、碱性处理和酶法制备的，这些方法存在反应时间长和效率低等缺点（Liu、Tang等人，2024年）。人们已经探索了物理辅助策略来提高共价结合效率。Zhang、Li等人（2022年）利用超声辅助碱性处理成功将EGCG共价修饰到乳铁蛋白上，显著缩短了接枝时间，从24小时缩短至40分钟。此外，使用化学试剂的安全风险也限制了这些方法的应用（Liu等人，2025年）。因此，Liu、Tang等人（2024年）利用冷等离子体在60秒内成功将没食子酸整合到卵白蛋白上，进一步缩短了接枝时间并消除了对化学试剂的需求，显著提高了接枝效率和环保性。然而，由于冷等离子体难以处理大量液体，其在工业规模连续生产中的应用受到限制。因此，迫切需要探索一种新型的、绿色、高效且可工业化的技术来诱导蛋白质和多酚的共价结合。
电子束辐照（EBI）是一种先进的非热食品加工技术，具有高效率、低运营成本和无化学污染的特点，已被世界卫生组织（WHO）、美国食品药品监督管理局（FDA）和国际原子能机构（IAEA）批准用于食品加工（Dong等人，2022年）。研究表明，低于10 kGy的辐照剂量是安全的，且不会损害食品的营养价值（Bai等人，2024年）。EBI被认为是一种有前景的蛋白质修饰技术。Zhang、Liu等人（2022年）利用EBI成功增强了鹰嘴豆泥蛋白的抗氧化能力、热稳定性和乳化性能。Bai等人（2024年）还证明了EBI在改善大豆11S球蛋白功能特性方面的有效性。然而，目前的研究主要集中在利用EBI直接物理修饰蛋白质上，关于EBI诱导蛋白质与多酚共价结合的报道较少。EBI可以在短时间内产生高能量，导致物质离子化和化学键断裂，从而产生大量高活性的自由基（Zhang等人，2025年）。我们假设EBI产生的自由基类似于自由基诱导方法中的氧化还原对，其中EBI产生的羟基自由基可能通过氧化PPI的氨基酸侧链形成共价键。茶多酚的主要成分之一表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）作为一种修饰剂，受到了广泛关注，用于优化蛋白质的功能特性（Zhang、Li等人，2022年）。这些自由基也可能将EGCG氧化为醌类物质，然后与蛋白质中的-NH2和-SH基团发生不可逆反应，形成C-N或C-S键。EBI处理有望克服传统方法和现有物理辅助诱导方法的局限性，提供一种新型的、绿色且高效的技术途径，用于诱导PPI和EGCG之间的共价结合。
因此，本研究的目的是成功制备EBI诱导的PPI和EGCG共价接合物（PPI-EGCG），并初步评估其在乳液制备中的潜在应用。选择了2、4、6、8和10 kGy的EBI剂量来诱导PPI和EGCG的共价结合。通过监测反应基团的变化和EGCG结合当量来验证PPI-EGCG的形成。随后，使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）、紫外-可见光谱（UV/Vis）、内在荧光光谱和表面疏水性（H0）研究了EGCG共价接枝对PPI结构的影响。随后，全面评估了PPI-EGCG的物理化学性质、溶解性、抗氧化活性、热稳定性和乳化能力。最后，将PPI-EGCG应用于乳液的制备，并对其Zeta电位、粒径和储存稳定性进行了表征。
材料
PPI购自中国上海的Yuanye公司。EGCG、Folin-Ciocalteu、5,5′-二硫代-(2-硝基苯甲酸)（DTNB）、8-氨基-1-萘磺酸（ANS）、1,1-二苯基-2-吡啶基肼（DPPH）和2,2′-偶氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）（ABTS）购自中国北京的Solarbio公司。还原性和非还原性蛋白质加载缓冲液（5×）和BCA蛋白质定量试剂盒由中国陕西的Zhhcbio公司提供。
PPI-EGCG共价接合物的制备
EBI处理：将PPI溶解在蒸馏水中
反应基团含量的变化
多酚在碱性或 aerobic 条件下容易被氧化为醌类物质，这些醌类物质容易与蛋白质中的亲核基团发生反应（Liu等人，2017年；Zhang、Li等人，2022年）。因此，在EGCG共价接枝前后测量了游离氨基、游离-SH基团和游离色氨酸含量的变化。
结论
本研究通过EBI处理成功促进了PPI和EGCG的共价结合。EGCG的共价接枝显著改变了PPI的二级和三级结构。EGCG的共价接枝导致PPI结构展开，从β-折叠转变为β-转角和无规卷曲。三级结构的变化表明，EGCG的共价接枝使埋藏的芳香氨基酸暴露在极性环境中，而EGCG与芳香氨基酸的共价接枝导致H0降低。
CRediT作者贡献声明
杨娜娜：撰写——原始草稿、软件使用、方法论设计、实验实施、概念化。李慧玲：数据验证、正式分析、数据管理。李奎：数据验证、正式分析、数据管理。尚关瑞宇：数据可视化、验证、正式分析。牛伟：实验监督、正式分析。江天：撰写——审稿与编辑、实验监督。雷宏杰：撰写——审稿与编辑、数据验证、资源获取、资金筹措、数据管理。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。
致谢
作者感谢榆林市科学技术计划项目（2023-NY-343）的财政支持，以及西北农林科技大学生命科学研究核心服务部门（Kerang Huang）的技术支持。
