《International Immunopharmacology》：Monocrotaline induces liver injury via TRX1-ASK1-JNK Axis-mediated mitochondrial damage in hepatocytes
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吡咯里西啶生物碱诱导的肝损伤机制研究中，单克罗托品（MCT）通过TRX1-ASK1-JNK通路引发氧化应激和线粒体功能障碍，最终导致肝细胞损伤。Selonsertib（SEL）作为ASK1抑制剂可有效缓解肝损伤。
作者名单：夏彩霞（Caixia Xia）、岑月雷（Yelei Cen）、姚守涵（Shouhan Yao）、徐思铎（Siduo Xu）、娄国华（Guohua Lou）、刘彦宁（Yanning Liu）、郑敏（Min Zheng）
中国国家传染病诊疗重点实验室、国家传染病临床研究中心、中新传染病研究与药物开发联合实验室、国家传染病医疗中心、传染病诊疗协同创新中心、浙江大学医学院附属第一医院，中国浙江省杭州市310003。
摘要
吡咯里西啶生物碱诱导的肝损伤（PAs-ILI）是一种由吡咯里西啶生物碱（PAs）暴露引起的严重肝脏疾病，通常表现为急性肝损伤，可能发展为肝硬化、肝衰竭或死亡；然而，其潜在机制尚未完全阐明。本研究使用单克罗他林（MCT）这一公认的PA，在小鼠模型中探讨了PAs-ILI的发病机制。通过RNA-seq、Western blot、ROS检测、线粒体膜电位和ATP测定、GSH定量、透射电子显微镜以及qRT-PCR等技术，我们证实MCT导致了明显的肝损伤，表现为血清生物标志物升高和组织病理学变化。MCT引发了肝脏氧化应激，其特征是ROS增加和硫氧还蛋白1（TRX1）显著抑制，导致线粒体功能障碍，表现为ATP生成减少、膜电位去极化以及ASK1-JNK促凋亡通路的激活。在HepG2细胞中的体外实验证实了MCT诱导的DNA损伤和ASK1依赖的JNK磷酸化，强调了该通路在细胞毒性中的核心作用。预先使用ASK1抑制剂Selonsertib（SEL）通过抑制ASK1-JNK激活并保护线粒体完整性，减轻了MCT诱导的肝损伤。这些结果表明，MCT通过TRX1-ASK1-JNK轴介导的线粒体损伤引发肝毒性，而SEL可以破坏这一级联反应，凸显了ASK1抑制在PAs-ILI治疗中的潜力。
引言
药物诱导的肝损伤（DILI）是由处方药、草药和膳食补充剂（HDS）或外源性物质特有的或剂量依赖性的毒性引起的多种肝脏病理表现[1]。中国DILI的发病率明显高于西方地区。特别是未经监管的传统中药产品的不当使用，被认为是中国DILI负担增加的主要原因。吡咯里西啶生物碱诱导的肝损伤（PAs-ILI）是DILI的一个重要亚型[2][3][4]。吡咯里西啶生物碱（PAs）[5]可导致肝细胞坏死和窦状内皮损伤，可能进展为窦状阻塞综合征。如果不加以治疗，病情可能发展为晚期肝病，包括进行性纤维化、肝硬化，最终出现危及生命的并发症，如急性肝衰竭和多器官功能障碍[6]。在中国，导致这种疾病的的主要因素是摄入含有PAs的传统中药，例如
Gynura segetum（俗称“Tu-san-qi”）[7]。迄今为止，科学家已在6000多种植物样本中确认了660多种PAs的存在，包括senecionine、单克罗他林、echinatine和lithospermine[8]。值得注意的是，Gynura segetum含有senecionine和seneciphylline，这两种物质都具有很强的肝毒性[9][10][11]。然而，PAs诱导的肝毒性的分子决定因素尚未完全明确。研究其发病机制有望为治疗和改善预后提供新的思路。
单克罗他林（MCT）天然存在于某些植物中，如Crotalaria属[12]，是研究PAs相关发病机制的常用模型药物[13]。MCT可引起肝脏、肺部[14,15]和肾脏[16]的毒性，其中肝毒性是主要的临床关注点[17,18]。最近的研究独立发现了导致MCT诱导肝损伤的一些机制。Ji M.等人表明，一种具有血栓调节蛋白类型1基序13的解聚酶和金属蛋白酶的水平降低，在MCT暴露后显著促进了肝微血管内血小板的过度粘附[19]。Zhao S.等人的研究揭示了肠道微生物失衡通过调节巨噬细胞向促炎M1表型的极化，在加剧MCT诱导的肝损伤中起的作用，这一过程与肠道上皮完整性受损有关[20]。Gong B.等人发现，全身炎症会放大MCT暴露的肝毒性，髓过氧化物酶在增强炎症级联反应对肝组织的损害中起关键作用[12]。我们旨在进一步阐明MCT诱导肝细胞损伤的分子机制。
氧化应激和线粒体功能障碍已成为多种药物和毒素诱导的肝损伤发病机制中的普遍介质，这些损伤涉及从治疗药物到生物毒素的各种病因因素。例如，APAP诱导的肝毒性是西方人群急性肝衰竭的主要病因，主要是由于
驱动的氧化应激耗尽了线粒体谷胱甘肽，导致线粒体膜通透性增加、ATP耗竭和程序性坏死[21]。类似地，脂多糖诱导的肝损伤（一种脓毒性肝病模型）会触发库普弗细胞激活和随后的活性氧（ROS）过量产生，这加剧了线粒体去极化和肝细胞凋亡[22]。
我们的研究旨在深入探讨MCT诱导的DILI的机制，特别关注氧化应激和线粒体损伤对MCT肝毒性的影响。此外，本研究还试图确定响应氧化应激并在MCT诱导的肝细胞损伤中调节线粒体损伤的关键分子。通过阐明这些新的机制和分子途径，本研究旨在发现治疗的新潜在靶点。
基于动物的研究
GemPharmatech有限公司（中国南京）提供了本研究所需要的雄性C57BL/6小鼠（18–22克，5–7周龄）。实验动物每笼5只，饲养在温度控制的房间（22 ± 2°C）中，光照/黑暗周期为12小时，并可持续获取水和饲料。所有实验方案均得到了浙江大学医学院附属第一医院动物护理和使用委员会的批准。MCT（纯度：99.8%）来源于...
MCT在小鼠模型中诱导肝损伤
通过小鼠过夜禁食后腹腔注射MCT（600毫克/千克）来模拟MCT诱导的肝损伤。模型建立24小时后，所有小鼠被处死。如图1A所示，MCT暴露导致明显的肝脏变色和表面瘀伤病变，而对照组样本中未见这些现象。通过H&E染色进行的组织病理学检查进一步显示，MCT给药引起了显著的肝损伤，表现为广泛的肝细胞坏死...
讨论
我们的研究发现，MCT通过TRX1-ASK1-JNK轴介导的线粒体损伤引发肝毒性，并突出了选择性ASK1抑制剂SEL在减轻MCT诱导的肝损伤中的治疗潜力（图6）。研究表明，ASK1在MCT诱导的肝毒性中起关键作用，它响应氧化应激并介导线粒体损伤。
与先前的报告一致[27]，MCT给药显著扰乱了肝脏的氧化还原状态...
结论
总之，MCT通过TRX1-ASK1-JNK轴介导的线粒体损伤引发肝毒性。SEL通过抑制ASK1来对抗这些效应，从而维持氧化还原平衡和线粒体完整性。这些发现不仅加深了我们对DILI发病机制的理解，还确定了ASK1抑制作为具有高转化应用价值的策略。
CRediT作者贡献声明
夏彩霞：撰写初稿、数据整理。
岑月雷：方法学设计、实验实施。
姚守涵：正式数据分析。
徐思铎：软件操作。
娄国华：项目管理和概念规划。
刘彦宁：撰写、审稿与编辑、资金申请。
郑敏：撰写、审稿与编辑、监督、资金申请。
作者声明
本手稿尚未在其他地方发表，也未被考虑出版。手稿的内容和出版已得到所有共同作者以及研究工作所在机构（浙江大学医学院附属第一医院）负责部门的批准。我们真诚希望该手稿符合发表要求，并非常感谢您考虑将其发表。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
本研究得到了中国国家重点研发计划（2023YFC2306800）、国家自然科学基金（U24A20773、82370613、82270624）以及国家传染病诊疗重点实验室独立任务的支持。
