基于酵母高通量筛选平台发现新型pre-mRNA剪接调节剂及其在癌症治疗中的潜力

《ACS Chemical Biology》：A Yeast-Based High-Throughput Screening Platform for the Discovery of Novel pre-mRNA Splicing Modulators

本综述介绍了一种创新的酵母高通量筛选（HTS）平台，用于发现能够调控pre-mRNA剪接的新型小分子化合物。研究团队通过双层筛选策略，成功鉴定出四种可在酵母体内引起未剪接pre-mRNA积累的化合物。尤为重要的是，其中一种化合物（C7）对表达骨髓增生异常综合征相关剪接因子突变（SRSF2P95H）的癌细胞表现出选择性敏感性。转录组分析揭示，C7处理能导致敏感细胞中基因表达和剪接结果的广泛改变。这项工作证明了基于酵母的HTS在发现具有生化及医学应用潜力的新型剪接调节剂方面的实用价值。

　　

引言

pre-mRNA剪接是真核生物基因表达的核心调控步骤，其过程涉及内含子的移除和外显子的连接，由剪接体（spliceosome）这一大型核糖核蛋白复合物催化执行。剪接体由五种小核RNA（snRNAs）——U1、U2、U4、U5、U6——及其相关蛋白质组成的小核核糖核蛋白（snRNPs）构成。剪接失调与多种人类疾病密切相关，包括癌症、神经系统疾病和罕见遗传综合征。然而，与靶向蛋白质翻译的丰富化学工具相比，能够直接靶向内源性剪接机制并调控剪接的小分子却寥寥无几。目前最广泛使用的剪接抑制剂主要靶向U2 snRNP蛋白SF3B1，例如pladienolide B和herboxidiene等。值得注意的是，尽管SF3B1在进化上高度保守，但其酵母同源物Hsh155却天然具有耐药性。通过将酵母Hsh155的特定结构域替换为人类同源序列，可以构建出对剪接抑制剂敏感的酵母菌株，这为研究剪接和内含子结构提供了有力工具。此外，剪接调节剂在临床上也展现出巨大潜力，尤其是在选择性杀死携带剪接因子突变的癌细胞方面。

材料与方法

本研究开发并验证了一个基于酿酒酵母（S. cerevisiae）的高通量筛选平台。该平台采用了双层筛选策略：初级筛选基于对敏感化酵母菌株的生长抑制进行测量，次级筛选则依赖于荧光蛋白的产生作为剪接抑制的读数。研究使用了四种酵母菌株：分别包含野生型（WT）或“人源化”的Hsh155/SF3B1或Brr2蛋白的菌株。筛选化合物库包括Selleck Chem FDA批准药物库、RIKEN天然产物库、Life Chemicals 4库以及美国国家癌症研究所（NCI）的DTP和NExT多样性库。筛选在384孔板中进行，通过测量24小时后的吸光度（OD₆₀₀）来评估生长抑制。筛选质量通过计算Z‘因子进行评估，所有筛选板的Z’因子均大于0.5，表明筛选质量可靠。次级筛选使用了两种荧光报告基因构建体：SPLIF（剪接框内）和SPLOOF（剪接框外），通过监测Venus荧光蛋白的表达变化来识别剪接调节剂。

初级筛选开发与结果

初级筛选旨在鉴定能够抑制酵母生长的化合物，因为pre-mRNA剪接对酵母存活是必需的。研究团队优化了酵母在384孔板中的生长条件，确定起始OD₆₀₀为0.0075时可获得良好的一致性和可重复性生长。使用phleomycin（一种抗菌剂）和herboxidiene（一种剪接抑制剂）作为阳性对照，分别用于抑制所有菌株和特异性抑制人源化Hsh155菌株的生长。在对FDA批准药物库的试点筛选中，成功鉴定出18种能抑制至少一种菌株生长的化合物，其中包括已知的抗真菌药物以及herboxidiene，后者仅在人源化Hsh155菌株中显示出抑制活性，验证了平台的区分能力。随后，筛选扩展至约35,000个化合物，最终从初级筛选中鉴定出379个“命中”化合物。这些化合物在抑制不同菌株生长方面表现出选择性，表明所选的酵母菌株确实对不同化合物具有不同的敏感化特性。通过SwissADME进行的计算机化学信息学分析显示，约70%的命中化合物符合Lipinski五规则，具有潜在的口服生物利用度特性，且91%的化合物通过了PAINS（泛 assay 干扰化合物）筛选。

次级筛选优化与结果

为了区分生长抑制是否与未剪接pre-mNA的积累相关，研究团队开发了基于荧光报告基因的次级筛选。SPLIF报告基因在剪接正常时产生Venus荧光，剪接抑制时荧光减弱；而SPLOOF报告基因则在剪接抑制时（内含子保留导致读码框恢复）产生荧光。使用herboxidiene验证该筛选系统，证实其能够检测到剪接抑制引起的荧光变化。RT-PCR实验进一步证实了herboxidiene处理会导致内源性MATa1转录本未剪接形式的积累。利用此系统对379个初级命中化合物进行筛选，最终鉴定出11个符合次级筛选标准的化合物。其中，腺苷类似物（如cordycepin和9-β-D-erythrofuranosyladenine, EFA）在所有测试菌株中均引起剪接报告基因荧光变化。其他命中化合物包括苯并噻唑和苯并恶唑类衍生物，显示出一定的菌株特异性。

命中化合物的验证与表征

通过RT-PCR检测内源性MATa1转录本第一个内含子的剪接效率，对11个次级筛选命中化合物进行进一步验证。结果显示，其中四种化合物（cordycepin、EFA、化合物C7和化合物C8）能显著引起未剪接RNA的积累，且其效力具有菌株依赖性。Cordycepin、EFA和C7在Hs-Hsh155菌株中引起最显著的未剪接RNA积累，而C8则在WT-Brr2和Hs-Brr2菌株中降低剪接效率。

剪接因子突变癌细胞对化合物C7的敏感性

为了测试这些化合物在人类细胞中的活性，研究团队评估了它们对等基因K562癌细胞（表达野生型SRSF2或突变型SRSF2^P95H）的抗增殖活性。结果显示，与野生型细胞相比，SRSF2^P95H突变细胞对化合物C7表现出显著降低的增殖能力，即选择性敏感。这种选择性敏感为针对携带特定剪接因子突变的癌症的潜在治疗策略提供了依据。

化合物C7的作用机制探索

为了探究C7的作用机制，研究首先在体外剪接体系中测试其效果。结果表明，即使在高达200 μM的浓度下，C7也未能显著抑制HeLa细胞核提取物中对标准AdML pre-mRNA底物的剪接，提示其可能不直接靶向核心剪接机制，或者其效应具有细胞类型或转录本特异性。随后，通过RNA测序（RNA-Seq）分析了C7处理对K562 SRSF2^WT和SRSF2^P95H细胞转录组的影响。差异表达基因（DEG）分析发现，C7处理在SRSF2^P95H突变细胞中引起了更多基因的上调，这些基因富集于细胞凋亡和死亡调控等过程，这可能是导致其增殖受损的原因之一。差异剪接分析（使用rMATS）显示，C7处理在两种细胞中均诱导了选择性剪接事件的变化，但绝大多数事件是细胞类型特异性的。在SRSF2^P95H突变细胞中，C7引起了更多数量的剪接改变，涉及转录调控、DNA/RNA代谢和翻译等多种生物学过程。这些转录组范围的扰动可能与观察到的增殖缺陷有关。

结论

本研究成功建立了一个基于酵母细胞的高通量筛选平台，并利用该平台鉴定出四种能够在酵母体内调控pre-mRNA剪接的小分子化合物。其中，化合物C7对携带癌症相关SRSF2^P95H突变的K562细胞显示出选择性抗增殖活性，其机制可能与调控凋亡相关基因表达和引发广泛的、突变细胞特异性的剪接重编程有关。该酵母筛选平台具有简便、经济、快速和可扩展的优势，为发现新型剪接调节剂并探索其治疗潜力提供了有效工具。未来的工作可集中于这些化合物（尤其是C7）的靶点去卷积以及其治疗应用的进一步开发。