《Journal of Advanced Research》：Time-series transcriptome and metabolome profiling Uncovers
WRKY6 and
WRKY23 as critical regulators in tobacco response to
Pseudomonas syringae infection
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本研究通过整合时间序列转录组与代谢组分析，解析了烟草响应丁香假单胞菌侵染的阶段性防御机制。研究发现WRKY6和WRKY23作为负调控因子，通过协调激素信号、鞘脂代谢及光反应通路，调控苯丙氨酸代谢和黄苷合成，从而影响植物免疫反应。该研究为作物抗病育种提供了关键分子靶点。
烟草作为重要的经济作物和模式植物，其生长和产量常受到多种生物胁迫的威胁。其中，由丁香假单胞菌致病变种引起的 wildfire 病害对烟草生产造成严重经济损失。尽管对该病原体的致病性已有较多研究，但烟草在感染过程中的动态防御机制仍不清楚。植物进化出双层先天免疫系统，包括由模式识别受体触发的免疫和由细胞内NLR蛋白介导的效应因子触发免疫。植物激素如水杨酸、茉莉酸和生长素在调控免疫应答中发挥核心作用，但其在防御响应中的具体功能及与免疫信号的互作机制尚不明确。随着组学技术的发展，多组学联合分析已成为解析植物-病原互作复杂调控网络的有力工具。然而，现有烟草病害研究多聚焦于单时间点或差异基因筛选，缺乏时间动态整合与关键调控元件的功能验证。
为系统性揭示烟草对丁香假单胞菌侵染的防御机制，中国烟草基因研究中心的研究团队在《Journal of Advanced Research》发表了题为"Time-series transcriptome and metabolome profiling uncovers WRKY6 and WRKY23 as critical regulators in tobacco response to Pseudomonas syringae infection"的研究论文。该研究通过整合时间序列转录组、代谢组分析及转基因功能验证，揭示了烟草在病原侵染过程中的阶段性防御策略，并鉴定出WRKY6和WRKY23作为负调控因子的关键作用。
研究采用的主要技术方法包括：对接种丁香假单胞菌的烟草叶片进行0、12、24、60小时时间点采样，开展RNA测序和广泛靶向代谢组检测；通过时间序列基因共表达网络和加权基因共表达网络分析筛选核心模块；利用病毒诱导基因沉默、CRISPR/Cas9基因编辑和过表达技术构建WRKY6/WRKY23转基因株系；通过组织化学染色检测活性氧积累，采用UPLC-MS/MS进行靶向代谢物定量。
烟草对丁香假单胞菌侵染的表型和生理响应
接种病原菌后，烟草叶片在24小时出现浅褐色斑点，60小时斑点颜色加深，病斑面积随时间显著扩大。激素检测显示水杨酸、茉莉酸和生长素含量在感染过程中持续上升，其中水杨酸积累最为显著，而脱落酸含量在12小时先下降后回升。这些结果表明激素信号通路在烟草防御响应中发挥重要作用。
时间序列转录组分析揭示阶段特异性应答
转录组分析鉴定出不同时间点的差异表达基因数量逐步增加，早期感染阶段基因功能富集于应激响应和激素调控，晚期则转向细胞稳态维持。光合作用相关基因在整个感染过程中持续下调，表明植物将能量重新分配至防御过程。KEGG分析显示早期阶段氨基酸代谢和次级代谢物合成通路活跃，晚期阶段半胱氨酸代谢和淀粉蔗糖代谢通路显著富集。
时间顺序基因共表达网络构建防御调控层级
通过TO-GCN分析将差异表达基因划分为10个时间层级，早期层级基因参与光合作用和生长平衡调节，中期层级调控能量代谢和蛋白质合成，晚期层级激活免疫响应相关通路。WRKY、ERF和NAC等转录因子家族在调控网络中处于核心地位，其中WRKY6和WRKY23在感染后期显著诱导表达。
代谢组图谱揭示防御相关代谢物动态变化
共鉴定2,768种代谢物，以生物碱、氨基酸及其衍生物、黄酮类为主。差异代谢物分析显示，苯丙烷代谢、碳代谢和2-氧代羧酸代谢通路在整个感染过程持续富集。早期阶段甘油磷脂代谢通路活跃，晚期阶段氮代谢和脂肪酸合成通路显著富集，表明烟草的防御策略从快速应答向持续代谢调整转变。
WRKY6和WRKY23负调控烟草对病原菌的抗性
亚细胞定位显示WRKY6和WRKY23定位于细胞核。基因沉默和敲除株系表现出增强的病原抗性，病斑面积减少42-58%，病原菌载量降低3.2-4.5倍，而过表达株系则出现更严重的病症。组织化学染色表明沉默株系中过氧化氢和超氧阴离子积累增强。相关性分析发现WRKY6/WRKY23与L-苯丙氨酸和黄苷代谢物显著相关，功能实验证实L-苯丙氨酸分支促进感病性，而黄苷分支赋予抗性。
讨论与结论
本研究通过多组学整合分析揭示了烟草对丁香假单胞菌侵染的时空防御机制。早期阶段植物通过激活激素信号和抑制光合作用优先分配资源用于防御，晚期阶段通过WRKY等转录因子调控次级代谢物持续合成。功能验证表明WRKY6和WRKY23作为负调控因子，通过调节活性氧积累和苯丙烷代谢影响植物免疫。该研究提出的两阶段防御模型深化了对植物-病原互作的理解，为作物抗病育种提供了关键分子靶点。未来研究应聚焦于WRKY转录因子与代谢物互作的空间调控机制，以及在重要作物中的保守性验证。
