通过丙基氯甲酸酯衍生化的气相色谱-质谱（GC–MS）方法同时测定短链脂肪酸和色氨酸代谢物

《The Journal of Climate Change and Health》：Simultaneous determination of short-chain fatty acids and tryptophan metabolites by a propyl chloroformate- derivatized GC–MS approach

短链脂肪酸与色氨酸代谢物的GC-MS/MS同步检测方法建立及其在MAFLD血清代谢组学中的应用，通过丙基氯甲酸酯衍生化优化实现19种代谢物的高效定量分析，发现isovaleric acid、quinolinic acid等代谢物在MAFLD与健康人群间差异显著，并与ALT、AST等临床指标相关。

　　

韩叶峰|何晓芳|龚月玲|李明晓|盛莉莉|郑宁宁|万建波|李后凯|李园园

上海中医药大学药学院，中国上海201203

摘要

短链脂肪酸（SCFAs）和色氨酸代谢物作为宿主-微生物群相互作用的关键介质，影响着生理和病理过程。为了全面阐明肠道微生物群在代谢性疾病中的潜在机制，需要同时量化这两种物质。然而，由于它们所含的羧基、氨基或酚羟基的不同，难以同时检测。在本研究中，我们的主要目标是利用基于气相色谱-三重四极杆质谱（GC–MS/MS）分析的丙基氯甲酸酯（PCF）衍生化方法，建立一种快速且灵敏的SCFAs和色氨酸代谢物定量测定方法。随后，我们将该方法应用于健康受试者和代谢相关性脂肪肝病（MAFLD）患者的血清样本检测。首先，我们优化了反应条件，包括PCF体积、反应时间、提取试剂比例和碱性试剂浓度，从而能够同时检测乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸、2-甲基戊酸、己酸、吲哚、琥珀酸、喹啉酸、吲哚乙酸、谷氨酰胺、吲哚丁酸、3-羟基安息香酸、褪黑素、犬尿氨酸、酪氨酸和色氨酸。2-氯-L-苯丙氨酸被选为内标。优化后的方法表现出良好的线性，日内/日间精密度范围为0.81%至14.88%，回收率范围为85.68%至114.50%，基质效应范围为85.81%至113.42%。此外，不同储存条件对样本稳定性的影响也在可接受范围内。最终，血清样本的定量结果显示，异戊酸、喹啉酸、吲哚乙酸、谷氨酰胺、褪黑素和酪氨酸在健康受试者和MAFLD患者之间存在显著差异。异戊酸、吲哚乙酸、谷氨酰胺、酪氨酸和色氨酸的水平与ALT、AST、Cap、Cr和TG等临床指标存在显著相关性，这为进一步的转化研究提供了依据。总之，该方法适用于SCFAs和色氨酸代谢物的定量测定，以及含有羧基、氨基和酚羟基的内源性代谢物。

引言

短链脂肪酸（SCFAs）和色氨酸代谢物受宿主遗传、免疫反应和饮食因素的影响，在通过肠道-宿主-微生物代谢轴的代谢过程中起着不可或缺的作用[1,2]。SCFAs主要通过结肠中的肠道微生物代谢或支链氨基酸的代谢产生，然后通过门静脉循环进入全身循环和组织分布，从而影响多种代谢性疾病（包括炎症性肠病、肥胖、糖尿病和代谢相关性脂肪肝病（MAFLD）的进展[3,4]。添加SCFAs（如丁酸钠）可能通过保护肠道免受损伤、减少肝脏脂肪变性、减轻肝脏炎症刺激和缓解氧化损伤来影响MAFLD的进展[5,6]。色氨酸代谢在微生物群-肝脏轴的连接中起着关键作用。绝大多数色氨酸通过犬尿氨酸代谢途径代谢，而大约1%的色氨酸代谢为5-羟色胺[7]。未被吸收的色氨酸被肠道微生物群转化为吲哚及其衍生物，主要包括吲哚乙酸、吲哚丙酸和吲哚丁酸，这些物质在MAFLD的进展中起着重要作用[8,9]。某些色氨酸代谢物（如吲哚）可以保护肝脏免受损伤和炎症，而犬尿氨酸或喹啉酸可能促进脂肪变性和肥胖[10],[11],[12],[13]。简而言之，微生物衍生的代谢物，特别是SCFAs和色氨酸代谢物，作为宿主-微生物群相互作用的关键介质，影响着生理和病理过程。为了全面阐明肠道微生物群在代谢性疾病中的潜在机制，需要同时量化这两种物质。

已经探索了多种分析方法来测定生物基质中的SCFAs或色氨酸代谢物。近年来，毛细管电泳、气相色谱（GC）或高效液相色谱（HPLC）由于灵敏度较低而较少使用，取而代之的是具有高选择性和灵敏度的GC/LC-质谱（GC/LC-MS）技术[14]。直接测定方法是使用GC–MS或LC-MS检测SCFAs和色氨酸代谢物的常见方法[15],[16],[17]。然而，这些方法仅适用于单一物种的代谢物，无法同时检测含有不同极性基团的多种代谢物。为了改善化合物的色谱行为，采用了多种衍生化方法。例如，之前曾设计过O-苄基羟胺标记法用于TCA循环代谢物和SCFAs的衍生化[18]。同位素编码的p-二甲氨基苯甲酰溴化物被用于含羧基代谢物的分析[19]。Dansylation（Dns）衍生化方法可用于单独定量胺类和酚类[20]。与传统衍生化方法相比，烷基氯甲酸酯衍生化方法具有更快的反应时间、更高的效率和更低的试剂消耗量，并且可以同时酯化含有羧基、氨基和酚羟基的代谢物，或与侧链连接的代谢物，这满足了大多数内源性代谢物的检测要求。

在各种烷基氯甲酸酯衍生化方法中，甲基/乙基氯甲酸酯是最常用的衍生化试剂[21]。然而，根据中国2021年的《危险化学品目录》，甲基/乙基氯甲酸酯被归类为高毒性化合物，对实验室人员存在较大的职业暴露风险。因此，在标准实验室条件下禁止常规使用。另一种常用的衍生化试剂苄基氯甲酸酯的溶解度非常低[22]。本研究开发了一种快速、低消耗、实用的丙基氯甲酸酯（PCF）衍生化方法，结合GC–MS技术，用于同时定量8种SCFAs和11种色氨酸代谢物。此外，该方法还应用于临床人体血清样本中SCFAs和色氨酸代谢物的定量，以观察健康受试者和MAFLD组之间的代谢物变化。

方法片段

化学物质和试剂

参考化合物乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸购自上海源业生物科技有限公司（中国上海）。己酸和2-甲基戊酸购自中国药品生物制品控制研究所（北京）。琥珀酸、谷氨酰胺、吲哚乙酸、吲哚丁酸、褪黑素、犬尿氨酸和色氨酸购自上海标准技术有限公司

衍生化和提取程序的优化

本研究采用了PCF衍生化的GC–MS方法来测定8种SCFAs和11种色氨酸代谢物，该方法可以同时酯化与苯相连的羧基、氨基或羟基，分别生成丙基酯（红色）或N(O)-丙基羰基醚（蓝色）。羧基/氨基/羟基首先与PCF反应，生成的中间体（I）随后与丙醇反应，生成第二个中间体（II），进一步进行...

讨论

本研究建立了一种基于GC–MS技术和PCF衍生化的快速且灵敏的SCFAs和色氨酸代谢物定量方法，并成功应用于健康受试者和MAFLD受试者的血清代谢物分析。在衍生化和提取的优化过程中，使用1 mol/L氢氧化钠溶液将pH调节至碱性条件，以便...

结论

总之，通过PCF衍生化的GC–MS分析建立了一种快速且灵敏的定量方法，可用于19种内源性代谢物的测定，包括8种SCFAs和11种色氨酸代谢物。该方法具有较短的衍生化时间、较低的试剂消耗量，并能准确定量更多代谢物，显示出高效率、优异的灵敏度和选择性。

CRediT作者贡献声明

韩叶峰：资源提供、方法学设计、数据分析。何晓芳：方法学设计、实验研究、数据分析。龚月玲：方法验证、资源管理、实验研究。李明晓：项目管理、方法学设计。盛莉莉：写作-审稿与编辑、项目管理、方法学设计。郑宁宁：方法验证、项目管理、概念构思。万建波：资源提供、项目管理。李后凯：项目管理、资金获取、数据分析。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（Houkai Li项目编号U21A20413，Yuanyuan Li项目编号82404823）和国家重点研发计划（Houkai Li项目编号2022YFC3502003）的财政支持。