《Scientific Reports》：First detection of Usutu virus in wild birds in Denmark, 2024
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本研究针对2024年丹麦野生鸟类中首次爆发的乌苏图病毒(USUV)感染事件展开系统调查。研究人员通过对149只死鸟（主要为乌鸫）进行病理学检查和RT-qPCR检测，发现56只乌鸫脑组织中存在高载量USUV RNA。全基因组测序揭示丹麦境内同时存在欧洲2型(EU2)、欧洲3型(EU3)和非洲3型(AF3)三种USUV谱系。该研究证实了USUV在北欧地区的建立，强调了对新发虫媒病毒加强监测的必要性，为预警西尼罗病毒(WNV)可能入侵提供了关键科学依据。
在欧亚大陆，一种名为乌苏图病毒(Usutu virus, USUV)的蚊媒病原体已悄然传播了近三十年。这种属于黄病毒科(Flaviviridae)正黄病毒属(Orthoflavivirus)的病毒，与更具知名度的西尼罗病毒(West Nile virus, WNV)亲缘关系密切。自2001年在奥地利野生鸟类中首次发现以来，USUV已扩散至欧洲多国，其典型特征是能在鸟类（尤其是乌鸫，学名Turdus merula）中引起致命性系统性疾病，导致种群数量显著下降。对人类而言，USUV感染大多无症状，但在免疫低下或老年人群中可能引发发热和神经系统症状。尽管USUV早已在丹麦的南部邻国德国存在多年，但直到2024年以前，丹麦本土始终未有该病毒现身的官方记录。然而，2024年这个被记录为丹麦史上第二湿润和第二温暖的年份，为蚊媒繁殖创造了绝佳条件，也为USUV的登陆与暴发埋下了伏笔。
2024年夏季，丹麦野生动物组织与哥本哈根大学兽医病理学系收到了超过千起关于虚弱或死亡乌鸫的报告，这拉响了警报。随之展开的系统性研究，首次证实了USUV在丹麦野生鸟类中的暴发，相关成果发表于《Scientific Reports》。研究团队对公众提交的149只死鸟（包括85只乌鸫）进行了详细的病理学检查和实验室检测。逆转录定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)结果显示，85只乌鸫中有56只的脑组织样本呈USUV RNA阳性，且多数病毒载量极高（Ct值<20）。此外，在两只好斑啄木鸟(Dendrocopos major)和一只红鸢(Milvus milvus)的脑组织中也检测到低水平的USUV RNA（Ct>30）。对阳性乌鸫的进一步检测发现，其肝脏、肾脏以及泄殖腔和气管拭子中同样存在USUV RNA，表明病毒感染是全身性的。最为关键的是，对25个样本进行的全基因组测序（使用Illumina MiSeq平台）成功获得了20个高质量全长USUV基因组。系统发育分析揭示，丹麦境内同时存在三种USUV谱系：欧洲2型(EU2，14例)、非洲3型(AF3，5例)和欧洲3型(EU3，1例)。这些谱系分别与匈牙利、意大利、奥地利（EU2）以及英国、德国、比利时（AF3、EU3）的毒株亲缘关系最近。病理学观察显示，感染乌鸫普遍出现消瘦、脾脏肿大、颅内出血和充血等病变，与欧洲其他USUV疫情报告一致。此次疫情的暴发与2024年丹麦异常温暖湿润的气候以及创纪录的库蚊(Culex mosquitoes)密度高度相关，气候变暖可能加速了病毒在蚊虫体内的复制。研究指出，USUV的入侵路径很可能是通过候鸟迁徙引入，而非蚊媒的直接扩散，因为库蚊的活动范围有限。同时，检测到三种不同谱系强烈提示病毒存在多次独立传入事件。这项研究不仅记录了USUV在丹麦的首次暴发，更重要的是，它敲响了警钟：既然环境条件已允许USUV立足，那么其“近亲”WNV的入侵风险也随之大增。因此，持续加强对鸟类、蚊虫以及人类病例的监测，对于保障公共卫生和动物健康至关重要。
主要技术方法概述
本研究主要应用了以下关键技术：1) 病毒基因组检测：采用病毒特异性RT-qPCR对鸟类脑组织等样本进行USUV和WNV RNA检测；2) 病理学检查：对提交的鸟类进行系统尸检，记录宏观病变并评分；3) 高通量测序与基因组组装：使用Illumina MiSeq平台对筛选出的USUV RNA阳性样本进行鸟枪法测序，通过生物信息学流程（包括TrimGalore、Kraken2、DIAMOND、MEGAHIT、metaSPADES等软件进行质控、分类和从头组装）获得全长USUV基因组，并对测序覆盖不全的区域辅以Sanger测序补洞；4) 系统发育分析：基于获得的全基因组序列，利用MAFFT进行比对，IQ-TREE构建最大似然系统发育树，分析病毒谱系来源与进化关系。所有测序数据源自2024年丹麦境内发现的死亡野生鸟类（主要为乌鸫）。
研究结果
病毒基因组检测与流行病学特征
对所有149只鸟类的脑组织样本进行RT-qPCR检测，WNV RNA均为阴性。但在85只乌鸫中，56只（65.9%）的脑组织检测到USUV RNA，且大部分呈现高载量（Ct值<20）。感染鸟类的性别和年龄未呈现明显规律。除乌鸫外，在两只好斑啄木鸟和一只红鸢的脑组织中也检测到低水平USUV RNA（Ct>30）。阳性乌鸫遍布丹麦大部分地区，南部病例数最多。对23只USUV阳性乌鸫的泄殖腔和气管拭子检测表明，其结果与脑组织定性相似，但在脑组织病毒RNA水平接近检测限时，拭子样本通常为阴性。对另外5只阳性乌鸫的肝脏和肾脏样本检测显示，病毒RNA水平与对应脑样本相当。
感染乌鸫的病理变化
尸检发现，感染乌鸫普遍呈现消瘦、羽毛暗淡蓬乱或不完整、胃内容物空虚等共同特征。最常见的器官宏观病变包括脾脏肿大、颅内出血和充血。部分鸟类死前行为观察描述显示，常见表现为虚弱、淡漠，有时伴有神经系统症状（如协调障碍）。
基因组测序与系统发育分析
从25个乌鸫脑样本（Ct值12.4-27.4）中成功获得20个高质量USUV全长基因组序列（长度10933-11035 nt）。系统发育分析表明，14个样本属于EU2谱系，5个属于AF3谱系，1个属于EU3谱系。EU2样本与来自匈牙利、意大利和奥地利的序列聚在一起；AF5序列与来自英国、德国和比利时的毒株聚在一起；唯一的EU3毒株与德国的EU3毒株聚在一起。
结论与讨论
本研究首次证实了USUV于2024年在丹麦野生鸟类中，主要是乌鸫种群中引起暴发。异常温暖湿润的气候和高密度的库蚊种群可能是病毒在该国建立和传播的关键环境驱动因素。研究揭示了三种USUV谱系（EU2, AF3, EU3）在丹麦共循环的现象，强烈提示存在多次独立的病毒引入事件，最可能的引入途径是候鸟迁徙。病理学发现与欧洲其他USUV疫情报告高度一致。除了主要影响乌鸫外，病毒还在其他鸟类物种（好斑啄木鸟、红鸢）中低水平检测到，提示其宿主范围较广。值得注意的是，在感染乌鸫的泄殖腔和气管拭子中检测到病毒RNA，提示除蚊媒传播外，粪口传播途径可能也具有一定潜在意义，值得进一步研究。
此次USUV疫情的发现具有重要的警示意义。历史经验表明，在一些欧洲国家，USUV的出现往往先于WNV的暴发，而WNV是欧盟规定的须通报疾病。丹麦的环境条件既然已能支持USUV的传播循环，那么WNV传入的风险也随之增加。因此，加强对这两种病毒的监测对于防范未来的公共卫生和动物健康风险至关重要。尽管USUV在人类中引起临床症状的病例相对罕见，且多集中于老年或免疫低下人群，但欧洲范围内由EU2谱系引起的人类感染病例呈上升趋势。因此，丹麦临床医生在诊治具有神经系统症状的患者时，应考虑到USUV感染的可能性。
总之，这项研究凸显了对新发病毒进行持续监测的重要性。虽然无法确定2024年是否是USUV传入丹麦的确切第一年，但多种因素（如近年乌鸫检测数量少、病毒在邻国和候鸟迁徙地的存在、以及丹麦多数地区检测到多种谱系）表明，病毒可能已存在一段时间。2024年的气候条件和蚊媒丰度很可能促进了USUV在丹麦的建立。此次疫情在表现上与欧洲其他描述相似：乌鸫种群数量下降、病理变化一致、并检测到三种不同的USUV谱系。鉴于该病毒对野生鸟类种群的影响、其人畜共患潜力以及其他欧洲国家USUV出现后WNV随之而来的先例，持续对鸟类、蚊虫和人类病例进行监测对公共和动物健康都至关重要。丹麦已通过参与欧盟项目加强了蚊媒监测，并提高了公众意识，这些措施对于未来应对类似新发传染病威胁具有重要意义。
