《Applied and Environmental Microbiology》：Genetic mechanisms for estuarine carbohydrate degradation and linked transcriptional activity
编辑推荐：
本研究通过宏基因组和宏转录组分析，揭示了河口浮游与底栖微生物群落降解碳水化合物（CAZymes）的遗传机制与表达差异。结果表明，底栖群落拥有更丰富多样的CAZyme基因（尤其是GH和PL家族），且整体转录水平更高；而浮游群落则更倾向于表达其CAZyme基因库。研究还发现β-1,3-葡聚糖（如海带多糖）降解基因在浮游环境中广泛表达，而α-葡聚糖（如淀粉）降解相关基因在两类群落中均活跃。该工作为理解河口碳循环的微生物驱动机制提供了新的分子生态学视角。
河口碳水化合物降解的遗传机制及关联转录活性
河口作为淡水与海水的交汇地带，尽管仅占全球海洋面积的0.2%–0.3%，但其碳循环能力远超许多其他环境。这些生态系统接收来自自生源（如藻类初级生产者和红树林）和外来源（如陆生植物）的多种有机碳形式。异养细菌驱动着这些有机碳的降解和再循环，它们被预期拥有多样化的碳水化合物降解遗传机制，以应对环境中遇到的有机碳的多样性和复杂性。本研究通过结合宏基因组和宏转录组方法，旨在阐明河口微生物群落中碳水化合物活性酶（CAZymes）的遗传基础及其表达模式，特别关注沿淡水-半咸水-海水盐度梯度以及水体和沉积物生境之间的差异。
CAZyme基因在沉积物原核生物种群中高度多样且活跃表达
研究在沿河口淡水至海水盐度梯度（两个非咸水点、五个半咸水点和两个海水点）采集了样本，获得了702个符合质量标准的宏基因组组装基因组（MAGs）。这些MAGs从底栖沉积物（373个）和上覆水柱（329个）中回收，涵盖了21个门。在所有702个MAGs中均鉴定出CAZyme编码基因，共检测到40,067个推定的CAZyme编码基因，归属于CAZyme六大类（AA、CBM、CE、GH、GT、PL）中的310个家族。碳水化合物降解主要由GH和PL类的CAZymes催化，本研究回收了多样化的降解性CAZyme基因，其中44%的CAZyme基因归属于139个GH家族和32个PL家族，约占所有已知GH和PL家族的70%。通过酶学委员会（EC）编号，为17,368个CAZyme基因推定了功能，其中12,642个能够匹配到45个底物类别中的至少一种。
CAZyme基因和转录本的组成强烈受生境（水体 vs 沉积物）和盐度（非咸水 vs 咸水）的影响。尽管河口大部分CAZyme基因库存在于从沉积物和水体群落中回收的MAGs中，但沉积物群落通常比水体群落具有更丰富的CAZyme基因（和家族）。平均而言，每个水体MAG中鉴定出18.6个CAZyme基因，而每个沉积物MAG中为30.5个，表明大多数沉积物群落中CAZyme编码密度更高。非咸水样本是个例外，其沉积物和水体群落之间的CAZyme丰富度相当。
对河口宏转录组的分析显示，在整个河口范围内，沉积物和水体群落之间的CAZyme基因表达水平存在显著差异。无论是在考虑所有CAZymes together还是单个CAZyme类别时，都观察到这种模式。在非咸水点（盐度0.2–0.3 ppt），沉积物中所有CAZyme类别的表达量都远高于水体样本。值得注意的是，在考虑了每个位点的基因组丰度差异（基因组覆盖度归一化的TPM）后，沉积物相对于水体表达更高的趋势仍然存在。输出的CAZymes（即带有信号肽的CAZyme基因）部分也观察到相同的趋势。
沉积物是高度异质性的生境，其组成异质性可能与“斑块状”的资源可用性有关。此外，水体中的群落可能积极消耗易降解的碳水化合物，留下微生物碎屑和其他难降解的底物沉向海底或输出到海洋。因此，沉积物微生物群落需要拥有利用多种形式碳水化合物的遗传机制，本研究结果正表明了这一点。
CAZyme基因在水体中转录更持续
尽管沉积物群落具有更高的CAZyme基因密度和整体基因转录水平，但浮游种群更倾向于活跃表达其CAZyme基因库。从水体中回收的MAGs collectively拥有针对26种推定底物的CAZyme基因。95%的浮游类群表达了至少一个针对碳水化合物底物的基因（而沉积物类群为67%）。此外，对于25种底物，拥有针对每种底物的特异性基因的浮游类群中至少有一半转录了那些基因。相反，沉积物群落拥有针对33种推定底物的基因，但发现拥有针对这些底物基因的类群中不到一半表达了它们。这可能表明沉积物群落具有更强的机会性降解碳水化合物的能力，这与该生境更大的异质性和资源斑块性一致。
CAZyme基因家族组成在水体和沉积物群落之间 largely overlapped。因此，我们发现两个生境中的大多数群落都活跃表达与以下方面相关的CAZyme基因：（i）回收微生物生物量和细胞生长（即肽聚糖）；（ii）利用各种结构多样的N-和S-取代的宿主聚糖和糖缀合物；（iii）降解丰富的结构多糖（如几丁质和β-葡聚糖）和储存多糖（如α-葡聚糖，包括淀粉），以及高度易降解的蔗糖。
除了上述底物类别，许多浮游群落成员还表达与阿拉伯半乳聚糖、果聚糖和α-半乳聚糖降解相关的基因。而底栖群落基于基因表达数据显示出对结构性木聚糖、果胶和β-半乳聚糖的偏好。观察到的某些推定底物偏好差异可能反映了底物的相对作用。例如，阿拉伯半乳聚糖是植物细胞壁的结构成分，并参与植物-微生物相互作用。果聚糖可以由细菌合成，也可以由植物作为储存多糖和环境应激反应的一种形式合成。在水生河口环境中，浮游群落可能暴露于这些底物并将其作为营养源加以利用。相比之下，木聚糖和果胶是植物中的结构多糖，呈现出由多种残基组成的极其复杂的结构。这些底物的复杂性可能需要时间来进行分解和利用，底栖群落可能更有利于竞争这些资源。
降解α-葡聚糖的GH13 CAZyme基因普遍转录
在所有CAZyme家族中，我们观察到只有与GH13相关的基因在整个河口梯度上的沉积物和水体群落中均有表达。GH13家族包含多样化的CAZymes，靶向各种α-葡聚糖，包括淀粉、糖原、右旋糖酐（细菌胞外多糖）和支链淀粉（真菌胞外多糖）。在整个盐度梯度上，我们观察到水体中的群落转录了更多与α-葡聚糖降解相关的GH13 CAZyme基因，例如编码α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶、异淀粉酶和新支链淀粉酶的基因；而沉积物原核生物群落更倾向于转录编码合成性GH13 CAZymes的基因，如淀粉合酶和1,4-α-葡聚糖分支（糖原）酶，这表明沉积物细菌在斑块生境中将碳水化合物库存作为一种生存策略。水解酶基因的转录在沉积物中具有空间异质性。
此外，我们通过转录的CAZyme基因的alpha多样性评估了底物降解的活跃竞争程度（或底物生物合成的功能冗余）。使用这种方法，两个生境中对淀粉的竞争最为激烈（基于水体和沉积物中表达的异淀粉酶基因以及水体中α-淀粉酶基因的辛普森多样性推断），并且水体中对支链淀粉（新支链淀粉酶基因）和寡糖（α-葡萄糖苷酶基因）的竞争也较高。然而，推定的竞争程度似乎取决于在河口中的位置，对这些α-葡聚糖的竞争在水体的低盐度区（非咸水和半咸水点，盐度0.3–8.5 ppt）最高。在沉积物中，α-葡聚糖生物合成的功能冗余在过渡性低盐度半咸水点（站点3，盐度8.1–9.4 ppt）同样最高。更高的类群丰富度通常意味着更高的功能多样性和冗余度。这或许解释了在过渡性半咸水沉积物点观察到的更高的α-葡聚糖降解和生物合成冗余，因为从该点回收的MAGs数量显著多于任何其他沉积物点（至少是两倍）。从水体中回收的MAGs数量在各点间相当，表明其他因素，如来自河流源的底物输入，是造成水体中非咸水区和咸水区之间α-葡聚糖竞争差异的原因。
浮游原核生物群落竞争β-1,3-葡聚糖
在沉积物和水体中推定降解的主要底物中包括β-葡聚糖。在水体中，大多数类群表达了预测可催化β-葡聚糖降解的CAZyme基因，其普遍程度仅次于肽聚糖。虽然纤维素是最丰富且最易识别的β-葡聚糖多糖形式，但其结晶形态在没有一套酶的情况下不易降解。基于回收基因数量的EC编号排名显示，纤维素酶基因在沉积物中常见，但在水体类群中 largely lacking，这反映了底栖群落降解可能来自潮间带红树林或河口邻近陆生植物的沉降难降解有机物的更强能力。
葡聚糖内切-1,3-β-葡萄糖苷酶（EC 3.2.1.39）基因在水体中尤其普遍。使用DESeq2、edgeR和limma进行的差异表达分析结果一致表明，编码这种CAZyme的基因表达在水体中显著更高，并且表达这些基因的MAGs数量多于其他内切葡聚糖酶（如α-淀粉酶和异淀粉酶）。葡聚糖内切-1,3-β-葡萄糖苷酶催化β-1,3-葡聚糖（如细菌凝胶多糖、眼虫藻 paramylon 和藻类海带多糖）的内切水解。这些底物在水生环境中天然丰富。在海洋环境中，海带多糖（β?1,3-连接，带有β?1,6分支）是β-葡聚糖的主要形式。
对葡聚糖内切-1,3-β-葡萄糖苷酶编码基因表达模式的进一步分析显示，其根据盐度和门类以及CAZyme家族进行划分。拟杆菌门（Bacteroidota）不管盐度如何都表达这些基因，而其他门类的表达则与特定的生境盐度相关：放线菌门（Actinomycetota）和疣微菌门（Verrucomicrobiota）主要在非咸水水体中表达，假单胞菌门（Pseudomonadota）仅在咸水水体中表达。这些表达模式反映了拟杆菌门和疣微菌门在水体中的分布。拟杆菌门是最丰富和普遍的门之一，而疣微菌门虽然相对罕见，但在非咸水水体中最为丰富。与拟杆菌门一起，放线菌门和假单胞菌门是另外两个最丰富和普遍的门。尽管普遍存在，这三个门在河口的非咸水和咸水区域都表现出分类组成的差异。这些组成差异可能解释了放线菌门和假单胞菌门在葡聚糖内切-1,3-β-葡萄糖苷酶基因表达上所表现出的生态位分化。
表达葡聚糖内切-1,3-β-葡萄糖苷酶基因的大多数拟杆菌门属于黄杆菌目（Flavobacteriales），这是一个以其广泛的碳水化合物降解能力而闻名的谱系。在非咸水水体中表达内切-1,3-β-葡萄糖苷酶基因的类群包括微杆菌科（Microbacteriaceae，放线菌门）和Opitutales目（疣微菌门）的成员。在咸水水体中表达葡聚糖内切-β-1,3-葡萄糖苷酶基因的假单胞菌门成员来自假单胞菌目（Pseudomonadales）和小杆菌目（Parvibaculales）。
葡聚糖内切-β-1,3-葡萄糖苷酶基因的表达也根据CAZyme家族进行划分，其中GH17家族的基因表达仅在咸水水体中发现，而GH16_3家族的基因表达跨越了整个盐度区间。咸水水体中的类群通常被发现编码并表达与这两个家族相关的基因。这些发现与目前关于这些CAZyme家族生态分布的知识一致。
CAZymes通常协同工作以降解底物，编码CAZymes的基因通常与其他CAZyme基因或编码转录因子、信号转导蛋白和转运蛋白的基因共定位。这些遗传结构可以从基因组组装中预测，被称为CAZyme基因簇（CGC）。我们发现大多数葡聚糖内切-β-1,3-葡萄糖苷酶基因是CGCs的一部分，并且大多数CGCs属于拟杆菌门谱系的MAGs。一个意想不到的发现是在放线菌门Luna-1亚群（Rhodoluna种群MAGs Ww148和Ww162）中存在并表达了三个靶向β-1,3-葡聚糖的CGCs，以及在这两个种群中另外10个靶向底物（如α-半乳聚糖、淀粉和宿主聚糖）的CGCs。
在Luna-1亚群中与β-1,3-葡聚糖基因表达相关的三个CGCs中，MAG Ww162中靶向β-1,3-葡聚糖的CGC（CGC3）预测包含四个GH16葡聚糖内切-β-1,3-葡萄糖苷酶基因（注释为EC 3.2.1.39），以及编码纤维二糖（β-1,3-葡聚糖解聚产物）特异性的ABC转运蛋白、LacI家族转录调节因子、RNA聚合酶sigma-70因子（信号转导）和GH1 β-葡萄糖苷酶的基因。我们还在MAG Ww148中检测到两个推定靶向β-1,3-葡聚糖的CGCs（CGC1和CGC2），其中CGC2与Ww162的CGC组成相似，尽管GH16内切β-1,3-葡萄糖苷酶基因的拷贝数较少。所有三个CAZyme基因簇中的基因在非咸水水体中都被活跃转录，表明放线菌门Luna-1亚群具有协调基因表达进行碳水化合物降解的能力。
结论
迄今为止的大多数研究通过碳水化合物的大小和一般性质（如溶解度、生物可利用度和微生物同化程度）来评估环境中的碳水化合物。本研究提出了基于基因组的更精细分析，阐明了由盐度和生境（即水柱与沉积物）分化的原核生物群落推降解的多糖。我们的研究结果揭示了河口沉积物中比水体更丰富的CAZyme编码基因库，表明其对多样化底物具有更广泛的代谢“准备状态”。结果进一步表明，沉积物中与碳水化合物降解相关的转录比例高于水体，这与先前的实验工作发现一致。相比之下，水柱中的碳水化合物降解原核生物，虽然CAZyme编码基因库多样性较低，但更倾向于表达其降解性遗传机制。虽然不同盐度区的生物分类组成不同，但我们发现参与降解底物（如α-葡聚糖和β-1,3-葡聚糖）的基因是无处不在的。我们的结果表明，河口原核生物群落积极降解自生有机碳（如微生物生物量）和更复杂的自生及外来有机碳（如红树林和陆生植物生物量）。我们的发现表明，水柱群落可能吸收大部分易降解底物，留下更大、更复杂的底物（如木聚糖和阿拉伯聚糖）由沉积物中的原核生物群落降解。最后，我们报告了在所有三个主要且普遍存在的河口门（拟杆菌门、假单胞菌门和放线菌门）中存在并表达推定靶向β-1,3-葡聚糖的CGCs，包括放线菌门Luna-1亚群。未来的工作需要评估群落中预测的酶功能的底物特异性。此外，碳水化合物降解已知涉及多个类群之间的协作。另一个探索方向是不同类群在利用复杂底物时的劳动分工程度。
