通过逐步筛选和优化生物工艺参数，在盐生光合球藻（Synechocystis salina M8）中实现高效PHB（聚羟基丁酸酯）的生产

《Biochemical and Biophysical Research Communications》：High-efficiency PHB production in Synechocystis salina M8 through sequential screening and optimization of bioprocess parameters

蓝藻S. salina M8在光照强度9773 lux、pH 8.07、温度31.97℃时实现2.73 g L?1干生物量及21.41% PHB含量，同时高效固定CO?（3.06–4.06%）并去除磷（94.2–99.8%）和硝酸盐（87.3–96.1%）。

　　

阮氏芳董（Nguyen Thi Phuong Dung）| 塔氏明安（Ta Thi Minh Anh）| 裴氏秋婉（Bui Thi Thu Uyen）| 刘氏秋霞（Luu Thi Thu Ha）| 道氏裕康（Dao Duy Khanh）| 阮氏堂全（Tran Dang Thuan）| 阮氏辉光（Tran Huu Quang）| 潘氏光堂（Phan Quang Thang）

越南科学技术院（VAST）下属的研究生科学技术大学（GUST），越南河内市义多区黄国越街18号，邮编10000

摘要

蓝细菌生产聚羟基丁酸酯（PHB）为实现净零二氧化碳排放和循环生物经济提供了一条有前景的途径。本研究评估了一种新分离的菌株 M8，以确定关键环境因素如何调节生物量积累和PHB合成。通过Plackett–Burman设计实验，发现光照强度（4500–13,500勒克斯）、pH值（5–9）和温度（25–35°C）是影响生物量生长的主要因素，而PHB积累仅受pH值显著影响。后续的Box–Behnken优化确定了使菌株表现最佳的参数：光照强度为9773勒克斯、pH值为8.07、温度为31.97°C。在这些优化条件下，S. salina M8的干生物量浓度达到2.73克/升，PHB含量占干生物量的21.41%，显示出高效的细胞内生物聚合物积累和强劲的生长能力。除了PHB生产外，该菌株还表现出强大的环境功能，具有显著的无机碳同化能力（3.06–4.06%）以及优异的磷酸盐（94.2–99.8%）和硝酸盐（87.3–96.1%）去除效率。这些特性使其适用于二氧化碳封存和废水生物修复。总体而言，结果表明精确的环境调控对于优化生物量产量和PHB产量至关重要。本研究为扩大蓝细菌培养规模以实现可持续的PHB生产提供了实用框架，支持循环生物经济发展和气候缓解策略的应用。

引言

全球塑料年产量约为4亿吨，由于其难以降解的特性，传统塑料在环境中长期存在，导致严重污染[1]。源自可再生资源的生物塑料因其可生物降解性和较低的环境影响而成为有前景的替代品。2023年，全球生物塑料产量达到218万吨，有望部分替代商业市场中的化石基塑料，为可持续经济做出贡献[2]。其中，聚羟基烷酸酯（PHAs）占总生物塑料产量的4.8%，预计到2028年这一比例将增加两倍[2]。聚（3-羟基丁酸酯）（PHB）作为PHA家族的关键成员，具有与聚丙烯相似的机械和热性能，在医学、包装、纳米技术和农业等领域有广泛应用[3]、[4]、[5]。

尽管潜力巨大，但PHB的商业化受到高生产成本的阻碍，其生产成本估计是传统石油基聚合物的约三十倍[4]。碳源是主要成本因素，占总生产费用的35–40%[6]、[7]。因此，大量研究集中在使用农业工业废弃物、废水和厌氧消化物作为原料的成本降低策略上[4]、[8]、[9]、[10]、[11]。然而，通过异养发酵生产微生物PHB在经济上仍不可行，这促使人们探索低成本的光自养合成方法[6]。

蓝细菌是一类多样的原核光自养生物，几乎存在于所有生态系统中，因其能够生产多种生物产品（包括碳水化合物、蛋白质、生物活性化合物和生物聚合物）而受到关注[12]。它们在PHB生产方面尤其具有潜力，因为它们能够将二氧化碳转化为细胞内碳储备，从而减少温室气体排放并实现可持续的聚合物合成[3]、[5]、[13]、[14]。蓝细菌中的PHB积累是对生理压力的细胞内能量和碳储存反应，其机械性能可与石化聚合物相媲美，并具有成本效益高的生产潜力[15]。已有多种蓝细菌菌株被用于PHB生物合成研究，包括Nostocales属的 CCC 444[16]、、，以及球形菌种 PCC6803[5]、[6]、[14]、[18]、[19]。

蓝细菌的新陈代谢、生长和PHB积累受到物理化学因素的强烈影响，包括光照强度、pH值、温度、二氧化碳浓度、曝气程度、营养物质可用性和培养时间[20]。无机碳的吸收取决于培养基的pH值，二氧化碳（CO₂）、碳酸（H₂CO₃）或碳酸氢盐（HCO₃^?）是主要的碳来源[21]。氮限制是一种常用的诱导PHB积累的策略[5]。最近的研究通过基因改造和优化培养条件（如pH值、光照、碳和氮供应以及磷浓度）进一步提高了PHB产量[5]、[6]、[14]、[22]、[23]。

传统上，物理化学因素的影响是单独研究的，当涉及多个变量时这种方法耗时较长。统计设计方法（如Plackett-Burman方法）可以快速筛选出关键因素，减少实验次数；而Box–Behnken设计则允许对这些因素进行数学优化，以最大化目标响应[24]、[25]、[26]、[27]。

本研究旨在：(i) 使用Plackett-Burman设计确定新分离的 M8中影响生物量和PHB生产的最大因素；(ii) 通过Box–Behnken设计优化这些因素以实现最大生物量和PHB产量；(iii) 在优化条件下评估 M8的生物量、PHB产量、二氧化碳封存和营养物质去除效率。这种方法不仅解决了生物塑料生产的经济和环境挑战，还有助于光自养微生物的可持续利用。

实验部分

化学品

分析级氯仿、次氯酸钠、甲醇和PHB标准品均购自德国达姆施塔特的Merck KGaA公司。所有其他分析级试剂均来自认证供应商，并按原样使用，以确保试剂的一致性，减少PHB提取、纯化和分析过程中的变异性。

蓝细菌来源及种子培养准备

蓝细菌菌株 M8（S. salina M8）来自先进材料实验室的藻类收藏库

确定显著影响 M8生长和PHB生产的关键因素

蓝细菌的发育和光合聚合物的生产受到物理化学和非生物因素的强烈调控。通过优化这些参数，可以显著提高生物量积累和生物塑料合成。基于这一原理，采用Plackett–Burman设计（PBD）评估了八个独立变量（包括光照强度、二氧化碳浓度、pH值、温度、曝气速率、氮浓度）的影响

结论

总之，本研究证明 M8是一个有效的蓝细菌平台，可用于综合生物聚合物生产和环境修复。通过Plackett-Burman设计的统计筛选，确定光照强度、pH值和温度是影响生物量积累的关键因素，而pH值是促进PHB合成的主要因素。后续的Box–Behnken设计确定了最佳条件，例如光照强度9773勒克斯、pH值8.07

CRediT作者贡献声明

塔氏明安（Ta Thi Minh Anh）：数据整理、形式分析、实验设计、资源获取、软件使用、初稿撰写。道氏裕康（Dao Duy Khanh）：数据可视化、软件使用、资源协调。阮氏堂全（Tran Dang-Thuan）：文本撰写与编辑、数据可视化、项目监督、实验设计、概念构思。阮氏辉光（Tran Huu Quang）：软件使用、资源协调、实验设计。潘氏光堂（Phan Quang Thang）：文本撰写与编辑、结果验证、项目监督、资源协调。阮氏芳董（Nguyen Thi Phuong Dung）：初稿撰写、资源协调、形式审查

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

感谢韩国先进科学技术院环境工程系的Jaewook Myung副教授使用气相色谱-火焰离子化检测器（GC-FID）技术支持从 M8生物量中提取PHB的定量分析工作。