绿原酸通过调节mTOR来延缓子宫内膜衰老：一项结合网络药理学、体外和体内研究的方法

《Biochemical Pharmacology》：Chlorogenic acid attenuates endometrial senescence via mTOR modulation: A combined network pharmacology, in vitro, and in vivo study

衰老子宫内膜细胞中氯ogenic酸的抗衰老作用及蜕膜化调控机制研究。CGA通过抑制P16/P21表达促进增殖，上调PRL/IGFBP1/FOXO1等蜕膜化标志物，同时激活mTOR/AMPK/SIRT1通路改善线粒体功能。

　　

李Woonghee | 宋Gwonhwa | 白Hyocheol

韩国大学生命科学与生物技术学院生物技术系，首尔02841，大韩民国

摘要

高龄产妇与不孕症的发生率增加有关，这通常是由于蜕膜化和胎盘形成过程受损所致。本研究阐明了绿原酸（CGA）作为咖啡中的主要多酚成分，在子宫内膜基质细胞（ESCs）中的抗衰老潜力。通过使用由传代次数诱导的衰老模型，CGA降低了衰老标志物（P16、P21）的水平，促进了细胞增殖，并上调了蜕膜化相关标志物（PRL、IGFBP1、FOXO1）的表达。在经过hTERT处理的永生化ESCs中，CGA通过上调线粒体复合体基因并恢复线粒体功能增强了线粒体的生成。对接和分子动力学分析显示，CGA与mTOR的结合亲和力很高（?8.29 kcal/mol），并在关键残基处形成了稳定的相互作用。CGA处理显著降低了老年小鼠子宫组织中的mTOR表达。通过调节mTOR/AMPK/SIRT1通路，CGA能够减轻衰老并促进蜕膜化。这些发现表明CGA是一种有前景的抗衰老候选物质，有助于改善子宫内膜功能并解决与高龄产妇相关的不孕问题。

引言

近年来，不孕症已成为全球性的公共卫生挑战，约有10%至15%的夫妇难以怀孕[1]。在导致不孕的各种原因中，高龄妊娠（超过35岁）是出生缺陷的重要风险因素，占所有妊娠案例的约5%[2,3]。40岁以上女性的自然流产率急剧上升至超过30%[4]。传统上，女性生育能力随年龄下降被认为是由于卵巢功能障碍，表现为卵巢储备减少，从而导致卵子质量下降，胚胎无法着床以及染色体异常[5]。然而，年龄导致的生育能力下降并不仅仅与卵巢问题有关。最近的研究表明，子宫蜕膜化和胎盘形成问题也是与衰老相关的生育能力下降的主要因素[6]。因此，为了有效应对与年龄相关的生育挑战并开发针对性疗法，有必要同时研究子宫因素和卵巢功能障碍。

蜕膜化是一个复杂的过程，其特征是非分化成纤维细胞样子宫内膜基质细胞（ESCs）在形态和功能上转变为上皮样蜕膜基质细胞，这一过程对人类月经周期中的生殖生理至关重要[7]。在蜕膜化过程中，ESCs会高度表达多种蜕膜化标志物基因，包括催乳素（PRL）、IGF结合蛋白-1（IGFBP1）和叉头框O1（FOXO1）。子宫内膜的适当蜕膜化对于滋养层的侵袭、胚胎着床以及妊娠的启动至关重要[8]。子宫内膜蜕膜化失败会导致不孕，因为这会阻止子宫内膜表现出接受性表型，从而阻碍囊胚的稳定着床[9,10]。大约三分之一的着床失败与子宫内膜接受性的降低有关[11,12]。在蜕膜化过程中，ESCs会进入急性衰老状态，表现为FOXO1和P16（由CDKN2A编码）的表达上调、细胞体积增大以及SA-β-Gal活性增加[13]。衰老细胞的积累会导致组织功能障碍和各种病理的发展，而衰老细胞的暂时存在可能对ESCs的适当蜕膜化过程有益。蜕膜化过程中的过度细胞衰老可能会损害子宫内膜的蜕膜化过程，并抑制其与滋养层的相互作用[14]。因此，最近关于子宫内膜的研究集中在使用抗衰老方法来消除衰老细胞并减轻蜕膜化过程中的细胞衰老，作为治疗与年龄相关不孕的策略。实际上，衰老是一个复杂的生物学过程，其特征是细胞和组织功能的逐渐下降，最终导致生理机能恶化。衰老的标志性特征描述了一个多因素过程，涉及基因组不稳定、端粒缩短、线粒体功能障碍和细胞衰老等相互关联的机制。值得注意的是，衰老只是衰老过程的一个标志，而不是衰老本身的同义词[15,16]。在生殖衰老中，子宫内膜基质细胞的过度衰老会加剧子宫功能障碍和着床失败。

绿原酸（CGA）是一种苯丙烯酸多酚化合物（图1A），可以从多种天然来源中提取，包括阿拉比卡咖啡（Coffea arabica）、绿茶（Camellia sinensis）、越橘（Vaccinium corymbosum）和马铃薯（Solanum tuberosum）[17]。大量临床前研究表明，CGA具有多种药理活性，包括抗氧化、保护肝脏、抗癌、抗菌和神经保护作用[18][19][20][21][22]。特别是，CGA对多种女性生殖系统疾病具有有益效果，如子宫内膜炎[23][24]和多囊卵巢综合征[25]。基于其临床活性，CGA受到了广泛关注。CGA在抗衰老领域具有很大的潜力和应用前景。例如，CGA通过增加Sirtuin-1（SIRT1）的表达来发挥抗衰老作用[26]。此外，最近在秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）中的研究表明，CGA通过激活胰岛素/IGF-1信号通路并增强DAF-16活性来发挥抗衰老作用[27]；然而，目前尚不清楚CGA是否会影响子宫衰老和子宫内膜衰老。因此，本研究旨在阐明CGA对子宫衰老和子宫内膜基质细胞的抗衰老效果。为此，我们采用了网络药理学方法系统预测CGA的潜在分子靶点和信号通路，为后续的体外和体内验证提供了理论基础。

试剂和化学品

绿原酸和雷帕霉素分别从Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）和MedChem Express（美国新泽西州蒙茅斯 junction）购买。这些化学品分别溶解在二甲基亚砜（DMSO）中，并以200 mM和1 mM的浓度储存。

本研究中使用的特异性抗体列于表1中，所有抗体均稀释在含有2% BSA的TBST溶液中。

药物和疾病靶点预测

为了识别CGA的潜在人类靶点，我们使用了多个数据库，包括GeneCards[1]。

绿原酸（CGA）和细胞衰老的靶点

为了探讨CGA在细胞衰老中的作用，我们采用了网络药理学方法。从GeneCards、HIT、STITCH、SwissTargetPrediction和TargetNet等数据库中识别出潜在的CGA靶点，共获得556个靶点。同时，从GeneCards中检索到623个与细胞衰老相关的基因。去除重复项后，确定了CGA和细胞衰老之间的41个共同靶点，并用文氏图表示（图1B）。

讨论

近年来，高龄产妇已成为一个重大的全球公共卫生问题，也是不孕症的主要诱因之一。根据社会普遍观点，女性生育能力随年龄下降通常归因于卵巢功能障碍。传统上，研究的重点一直集中在卵巢储备和胚胎质量上。然而，最近的研究表明，子宫蜕膜化和胎盘形成问题也是导致生育能力下降的重要因素。

CRediT作者贡献声明

李Woonghee：撰写初稿、数据可视化、结果验证、软件使用、方法设计、实验实施、数据分析、数据整理。宋Gwonhwa：撰写修订稿、资源协调、项目管理、资金筹集、数据整理、概念构思。白Hyocheol：撰写修订稿、结果验证、实验监督、资源协调、资金筹集、概念构思。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

本研究得到了以下机构的财政支持：韩国国家研究基金会（NRF）（资助编号：2021R1A2C2005841和2022R1C1C1007067）。此外，本研究还得到了庆熙大学（KHU-20241102）的资助。