《Bioresource Technology Reports》：Increasing
Pseudomonas aeruginosa rhamnolipid biosynthesis using appropriate promoter-regulator-vector-host combinations for application at oil-contaminated surfaces
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鼠李脂生物合成基因在枯草芽孢杆菌中同源与异源表达系统的比较研究，重点分析启动子、载体及宿主选择对产率的影响，探讨工业放大中营养需求、选择压力及代谢负担等关键挑战，并提出人工微生物群（AMC）协同生产策略。
Rachel Veronica R和Mary Elizabeth Gnanambal Krishnan
印度泰米尔纳德邦金奈Porur市Sri Ramachandra高等教育与研究学院（SRIHER，被认定为大学）生物医学科学与技术学院生物技术系，邮编600 116
摘要
羟基脂质（rhamnolipids）的众多用途之一是用于烃类污染的修复，这些物质由高效的细菌Pseudomonas aeruginosa产生。尽管P. aeruginosa以自然产生大量羟基脂质而闻名，但研究人员一直在寻找能够产生同等量羟基脂质的替代细菌种类。20世纪90年代初，人们尝试通过基因工程改造同源（产生羟基脂质的）和异源（不产生羟基脂质的）菌株来提高羟基脂质的产量。本文详细比较了P. aeruginosa中羟基脂质生物合成基因的同源和异源表达方式，重点讨论了不同的启动子、载体和调控元件。虽然关于P. aeruginosa中羟基脂质生物合成基因rhlABC的克隆已有大量系统综述和元分析，但仍缺乏将同源和异源表达系统与产量以及工业生产中的实际问题（如产量波动）联系起来的信息。因此，本综述全面分析了菌株、启动子和载体的选择，以及启动子与质粒的兼容性、关键决定因素、营养需求（如适用情况）、接种量、培养时间、毒力基因敲除以及竞争性代谢途径的减弱突变等问题。本文的研究范围涵盖了1994年至今的P. aeruginosa rhl基因同源和异源表达的相关进展。研究结果强调了正确选择启动子、载体、碳源和接种量等关键因素的重要性，为研究人员提供了明确的操作指南。
引言
独特的表面活性化合物——羟基脂质（oil glycolipids）最早于1946年在Pseudomonas pyocyanea（现称为P. aeruginosa）中被发现（Bergstr?m, Theorell和Davide, 1946a; Bergstr?m, Theorell和Davide, 1946b），随后Jarvis和Johnson（1949年）阐明了其化学结构。Pseudomonas glumae（现称为Burkholderia glumae，最早的相关报道见于Manso Pajarron等人，1993年；Urakami等人，1994年）是最早被证实能大量产生羟基脂质的细菌属之一。羟基脂质的分子量介于300至1500 Da之间，具体取决于其是否被归类为表面活性剂或乳化剂；B. glumae能够同时产生这两种类型的羟基脂质。作为一种两亲性分子，羟基脂质包含一个或两个通过糖苷键连接的(L)-鼠李糖分子和一到两个β-羟基脂肪酸（Chong和Li, 2017）。羟基脂质具有表面活性、乳化作用、发泡效果和抗菌特性等多种有益性质。由于其低毒性和高生物降解性，这类化合物在许多领域都有广泛应用，其中最著名的应用是烃类污染的生物修复（Dittmann等人，2023年）。
已知羟基脂质能在油水/气界面形成一层光滑的保护层，从而增加烃类物质的生物可利用性，有助于微生物更好地将其溶解为水包油或油包水乳液（Banat等人，2014年），这使得羟基脂质在烃类生物修复中备受青睐。因此，需要通过基因工程实现羟基脂质的同源或异源表达以提升产量。然而，目前尚缺乏关于P. aeruginosa rhl基因同源和异源克隆的系统性研究，尤其是针对兼容载体-启动子-宿主系统的选择。
Pseudomonas aeruginosa无疑是迄今为止最高效的羟基脂质生产菌株（Li, 2017）。在该菌株中，羟基脂质的生物合成过程分为三个步骤：rhlA基因编码RhlA（rhamnosyltransferase链A），利用3-羟基脂肪酸作为前体合成HAAs（3-(3-羟基烷酰氧)烷酸）；rhlB基因编码RhlB（rhamnosyltransferase链B），通过dTDP-L-鼠李糖和HAA分子合成单羟基脂质；rhlC基因编码RhlC（rhamnosyltransferase 2），在已形成的单羟基脂质基础上再添加一个dTDP-L-鼠李糖以生成双羟基脂质。根据所含鼠李糖的数量，羟基脂质可分为单羟基脂质和双羟基脂质。
迄今为止，天然菌株的最大产率为70.56克/升（Zhu等人，2012年），而经过改造的菌株单羟基脂质的产率为约26克/升，双羟基脂质的产率为57.8克/升。因此，P. aeruginosa是研究羟基脂质基因簇结构、序列长度、启动子及相关调控因子的理想菌株（Chong和Li, 2017）。Ochsner等人在1994年发现了P. aeruginosa中的羟基脂质合成基因，这推动了通过同源和异源克隆技术大量生产表面活性剂的应用。鉴于羟基脂质在烃类生物修复中的重要作用，提高其产量具有重要意义，因此相关科学研究十分活跃。
章节摘要
本综述是否扩展了现有知识体系？
自2012年以来，已有大量文章系统地探讨了不同原核菌属（主要是Pseudomonas和Burkholderia）中rhl基因的克隆要求（Filbig等人，2023；Kumar等人，2023）。研究者考虑了质粒、宿主、启动子及调控元件等多种因素，以确定实现最大和持续分泌羟基脂质的最佳方法。
P. aeruginosa中rhl基因同源克隆和表达的启动子-调控元件-质粒兼容性
rhlAB基因的首次同源克隆可追溯至1994年（Ochsner等人，1994年），随后几年中，研究人员使用P. fluorescens、P. oleovorans、P. putida、E. coli DH5α等宿主进行了异源克隆，将rhlABRI和rhlAB基因簇共同克隆到这些宿主中（Ochsner等人，1995年）。其中rhlR基因编码RhlR蛋白（转录激活因子），rhlI基因编码丁醇-L-高丝氨酸内酯（C4-HSL）的合成酶（一种自诱导剂）。P. aeruginosa中rhl基因异源克隆和表达的启动子-调控元件-质粒兼容性
自20世纪90年代初以来，常用的同源和异源表达启动子包括lac（Kryachko等人，2013）、tac（Ochsner等人，1994）和T7（Wang等人，2007），以及具有调控序列的天然启动子。对于异源表达，除了lac和T7之外，还经常使用其他类型的启动子。
营养因素
微生物的遗传背景、碳源和氮源的选择、发酵条件以及后续回收技术都是影响羟基脂质生成的关键因素。本综述强调了这些因素对羟基脂质生物合成的重要性。
P. aeruginosa rhl基因同源和异源克隆的显著差异
同源克隆和异源克隆在产率上存在明显差异：尽管只有少数P. aeruginosa菌株能够进行同源克隆，但多种细菌（如Cellvibrio japonicus、Pseudomonas、Burkholderia和E. coli）均可作为异源宿主。在1994年至2025年的三十年间，双羟基脂质的报道仅有四次，而单羟基脂质的产量则更为常见。
主要挑战
目前，食品、化妆品和石化工业中使用的羟基脂质主要依赖于基因工程改造的Pseudomonas菌株。然而，高效合成这些化合物面临两大障碍：1. 需要高效且稳定的Pseudomonas菌株；2. 改造菌株的工业化放大生产。
主要结论
与以往关于羟基脂质合成的研究一致，P. aeruginosa依然是最常用的生产菌株（产率最高，达70.56克/升），尚未有其他野生或改造菌株超越这一纪录。无论采用何种启动子进行异源表达，同源表达的结果均更为显著（具体数据见图5）。
虽然我们提出了高效的羟基脂质合成模型，但未来发展方向在于人工微生物联合体（AMC），因为它们能够将生物合成的代谢负担分散到多个菌株上，而非依赖单一宿主完成所有步骤。羟基脂质的合成需要脂肪酸衍生的β-羟基酰前体和糖核苷酸中间体的协同供应。
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Rachel Veronica R: 负责撰写、审稿和编辑；初稿撰写；数据可视化；数据分析；形式化分析。
Mary Elizabeth Gnanambal Krishnan: 负责撰写、审稿和编辑；初稿撰写；项目监督；资金申请；数据管理；概念构思。
利益冲突声明
作者声明不存在可能影响本文研究的已知财务利益或个人关系。
