21世纪,冠状病毒家族引发了三次重大的动物源性大流行病: SARS-CoV (2003年)、MERS-CoV (2012年) 和 SARS-CoV-2 (2019年)。这些β-冠状病毒共同导致了灾难性的全球健康后果,造成数百万人死亡、经济持续不稳定以及深刻的社会变革 [1], [2]。尽管与早期的sarbecovirus在基因组上具有高度同源性 (与SARS-CoV的核苷酸同源性为79%, 与MERS-CoV为50%), SARS-CoV-2表现出独特的病毒学适应性,这为其大流行轨迹奠定了基础。这些适应性包括延长的潜伏期 (中位数为5.6天)、优化的空气传播效率 (在易感人群中R0=2-3),以及无症状病毒排毒——这些进化创新使得病毒能够在社区中持续传播 [3], [4]。
根据世界卫生组织2023年11月的流行病学监测数据,此次大流行达到了前所未有的规模:全球确认病例7.72亿例,额外死亡698万例,接种疫苗剂量达135亿剂,覆盖全球69.7%的人口 [5]。尽管针对多种疫苗平台 (mRNA、腺病毒载体、蛋白亚单位) 和单克隆抗体疗法的快速开发,但仍存在两个关键生物学挑战: 1) 抗原漂变导致连续出现免疫逃逸变异株 (尤其是Alpha、Delta和Omicron谱系,其刺突蛋白突变超过30个); 2) 随着免疫力减弱和病毒进化,疫苗突破性感染的发病率增加。这些双重生物学挑战要求转向基于机制的抗病毒药物研发 [6]。计算方法,包括基于结构的虚拟筛选、人工智能驱动的分子动力学模拟和保守结构域靶向,为设计广谱蛋白酶抑制剂提供了变革潜力,以有效对抗当前的和未来的sarbecovirus。
3CL蛋白酶 (3CLpro,也称为主要蛋白酶 (Mpro) 或非结构蛋白5 (Nsp5),是冠状病毒中一种关键的半胱氨酸蛋白酶,在病毒复制中起关键作用。该酶通过精确切割11个保守位点,将两个大的复制多聚蛋白 (pp1a和pp1ab) 蛋白水解为16个功能性非结构蛋白 (nsps),这些蛋白对病毒复制和传播至关重要 [7], [8]。结构研究表明,3CLpro采用类胰凝乳酶的折叠结构,分为三个不同的结构域 (I-III),其催化活性形式以同源二聚体形式存在 [9]。该酶的催化二聚体Cys145-His41位于I和II结构域的交界处,通过独特的催化机制发挥其蛋白水解功能 [10]。底物结合口袋包含四个关键位点 (S1', S1, S2和S4),能够特异性识别切割位点,尤其是nsp4和nsp16之间的位点 [11]。这种精确的底物特异性结合酶的自处理能力,确保了病毒多聚蛋白的精确成熟。值得注意的是,3CLpro在冠状病毒物种间具有显著的序列保守性,但与人类蛋白酶无结构同源性 [12]。这些独特特性使其成为开发广谱抗病毒药物的理想靶点,以对抗当前和新兴的冠状病毒感染。
近年来,关于SARS-CoV-2病毒蛋白的生化和结构数据的快速积累显著加速了3CLpro抑制剂的发现和优化。Owen等人 [13] 在这一领域取得了里程碑式的成就,他们首次开发了PF-00835231这种肽模拟抑制剂,随后优化为PF-07321332 (nirmatrelvir)。该化合物是nirmatrelvir/ritonavir组合 (Paxlovid?) 的活性成分,是首个获批用于治疗SARS-CoV-2的3CLpro抑制剂。尽管取得了治疗效果,但肽模拟抑制剂存在固有的药理学局限性,如膜通透性差和代谢不稳定 [14]。例如,nirmatrelvir需要与ritonavir联合使用,后者是一种细胞色素P450 (CYP450) 抑制剂,作为药代动力学增强剂,以达到临床有效的血浆浓度。这些挑战激发了人们对非肽类小分子抑制剂的兴趣,与肽模拟抑制剂相比,非肽类抑制剂在口服生物利用度、代谢稳定性和合成可行性方面具有明显优势。
根据3CLpro的作用机制,非肽类抑制剂大致可分为两类:非共价抑制剂和共价抑制剂。尽管具有非肽类骨架,共价抑制剂含有能与催化残基Cys145形成可逆或不可逆共价键的特定“头部”。相比之下,非共价抑制剂不与Cys145形成共价键,仅依靠非共价相互作用实现高亲和力结合。非共价抑制剂通常具有几个关键的药效团特征:高选择性,降低脱靶毒性的风险;良好的药物特性和药代动力学性质;可逆的抑制动力学,降低药物耐药性的可能性;以及广谱的抗冠状病毒活性 [15]。本研究重点设计和合成了一系列非共价3CLpro抑制剂,这些抑制剂具有高选择性、良好的药代动力学性质和广谱抗冠状病毒活性。
新兴研究表明,中药成分作为双靶点药物具有治疗潜力,能够同时抑制病毒蛋白酶和调节致癌途径。例如,myricetin是一种天然存在的黄酮类化合物,对3CLpro具有强大的抑制作用 (IC50 = 0.63 μM),并在乳腺癌和肝细胞癌模型中显示出抗肿瘤效果 [16]。Baicalein对3CLpro的抑制活性较强,IC50值为1.18 μM;来自连翘的皂苷A也对3CLpro具有抑制作用,IC50值为22.26 μM。此外,这些化合物同时对乳腺癌和肝细胞癌具有明确的抗癌效果 [17], [18], [19], [20], [21]。受传统药物化合物的双重抗病毒和抗癌潜力的启发,结合我们对新型3CLpro靶向治疗的兴趣,本研究采用基于结构的药物发现方法。通过分子对接和基于药效团的虚拟筛选Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology (TCMSP)数据库,并结合分子动力学 (MD)模拟,我们从Stellariae Radix中鉴定出一种具有生物活性的化合物作为先导化合物。后续的合理设计和合成产生了一系列新型联苯衍生物,这些衍生物在增强3CLpro抑制作用的同时,还改善了药代动力学性质,并将抗肿瘤作用作为次要治疗目标。
