从使用乳酸菌Lactococcus lactis NRRL B-50572发酵的牛奶中提取的新型生物可利用降胆固醇肽

《Food Research International》：Novel bioavailable hypocholesterolemic peptides derived from milk fermented with Lactococcus lactis NRRL B-50572

本研究旨在鉴定由Lactococcus lactis NRRL B-50572发酵的牛奶产生且具有HMGCR抑制活性的生物可利用肽。通过体外、体外及计算生物学方法（模拟胃肠消化、HPLC分离、LC-MS/MS鉴定及3D-QSAR建模等），发现10个有效抑制肽，其中4个（VAFVK、FPGPI、PVEPF、APFPE）因与HMGCR催化口袋形成氢键而表现出最佳结合亲和力和稳定性，提示该发酵乳制品可能通过抑制胆固醇合成降低LDL-C水平。

　　

Miguel A. Rendón-Rosales | María J. Torres-Llanez | Joel S. García-Romo | Lilia M. Beltrán-Barrientos | Miguel A. Mazorra-Manzano | Adrián Hernández-Mendoza | Aarón F. González-Córdova | Belinda Vallejo-Cordoba

食品与开发研究中心（CIAD），地址：墨西哥索诺拉州埃莫西略市Gustavo Enrique Astiazarán Rosas街46号，邮编83304

摘要

本研究旨在通过结合体外（in vitro）、离体（ex vivo）和计算机模拟（in silico）研究，识别出具有3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶（HMGCR）抑制活性的生物可利用肽，这些肽来源于使用Lactococcus lactis NRRL B-50572（FM-572）发酵的牛奶。为此，FM-572经历了模拟胃肠道消化（SGD）和离体肠道吸收过程，并对肽组分中的HMGCR抑制活性进行了评估。结果表明，FM-572中的吸收肽含量与未发酵牛奶无显著差异（p > 0.05）。然而，经过SGD和离体吸收过程后，FM-572肽组分的HMGCR抑制活性（IC50）显著高于未发酵牛奶（p < 0.05）。随后，通过RP-HPLC分离出吸收的肽（即生物可利用肽），并对色谱组分（CF）中的HMGCR活性进行了进一步分析。通过LC-MS/MS技术从CF中鉴定出106种肽，但最终仅选出了76种IC50值≤41.6 μg/mL的肽。对这些选定肽进行了全面的生物信息学分析，结合3D-QSAR建模、分子对接和分子动力学模拟，确定了具有HMGCR抑制活性的肽。其中四种肽（VAFVK [乳转铁蛋白，225–229], FPGPI [β-CN，77–81], PVEPF [β-CN，130–34], APFPE [αS1-CN，41–45]）在酶的催化口袋中表现出最佳的亲和力和稳定性，这可能是由于形成了分子间氢键。因此，这些发现表明FM-572释放的肽具有生物可利用性，并能抑制HMGCR酶，从而可能降低胆固醇水平。

引言

高胆固醇血症是一种代谢性疾病，其特征是血液中致动脉粥样硬化的低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平升高（Alloubani等人，2021年），它是包括心血管疾病和脑血管疾病在内的多种血管疾病的致病因素（Shang等人，2024年；?li?等人，2019年）。为了控制高胆固醇血症，采用了药物治疗和生活方式调整等策略（Hendrani等人，2016年）。药物治疗主要使用他汀类药物，这类药物可以抑制3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶（HMGCR）（Bartlomiejczyk等人，2019年）。由于HMGCR是内源性胆固醇代谢的关键酶，抑制该酶能有效降低LDL-C水平（Gesto等人，2020年）。另一方面，生活方式的调整包括采用健康饮食等。功能性食品和营养补充剂的摄入已成为高胆固醇血症治疗的辅助手段（Cicero等人，2021年）。事实上，国际临床指南推荐使用特定功能性食品来管理血脂异常（Mach等人，2020年）。

研究表明，发酵乳制品（例如发酵牛奶）可以降低胆固醇水平。此外，多项荟萃分析和观察性研究显示，食用发酵乳制品与降低心血管风险存在显著关联（Rizzoli & Biver，2024年；Zhang等人，2020年；Ziaei等人，2021年）。特别是由乳酸菌（LAB）属细菌发酵的牛奶，在体内表现出降胆固醇效果（Ziaei等人，2021年）。尽管多种乳酸菌都显示出降胆固醇作用，但这些效果通常归因于益生菌相关的机制（如胆盐解离、胆固醇吸收）。然而，值得注意的是，在益生菌或非益生菌的发酵过程中，可能会释放出具有多种有益作用的生物活性化合物（如肽）（Chourasia等人，2023年）。目前关于从牛奶发酵中获得的降胆固醇肽的研究仍然有限。

在先前的研究中，发现野生型乳酸菌Lactococcus lactis NRRL B-50572在发酵过程中会释放出能够抑制与心血管代谢疾病和神经退行性疾病相关的酶的肽组分（Castro-Salomon等人，2024年；Rendon-Rosales等人，2022年；Rodríguez-Figueroa等人，2012年）。此外，在胆固醇水平正常的降压大鼠中，给予Lactococcus lactis NRRL B-50572发酵的牛奶可显著降低LDL胆固醇水平（Rodríguez-Figueroa等人，2013年）。最近的一项使用高胆固醇小鼠模型的研究也证实了这一点，该研究表明，热处理后的FM-572摄入可显著降低血浆LDL-C水平。此外，还观察到血浆LDL-C与肝脏脂质含量之间存在显著关联，表明这种发酵牛奶与其他乳酸菌发酵的牛奶相比能够调节胆固醇代谢（Rendón-Rosales等人，2023年）。综上所述，这些发现提示发酵牛奶中的生物活性肽（尤其是具有HMGCR抑制活性的肽）可能是导致降胆固醇效果的原因。因此，本研究的目的是识别经过模拟胃肠道消化和离体肠道吸收后，从FM-572中提取的具有HMGCR抑制活性的潜在生物可利用肽。

化学试剂与材料

M17培养基和乳糖由DIFCO公司（美国马里兰州斯帕克斯）提供。HMG-CoA还原酶测定试剂盒、猪胃黏膜来源的胃蛋白酶（P7000，806 U/mg蛋白质）、符合USP标准的猪胰腺胰酶（P7545，酶活性200 U/mg固体）、鸡蛋白白来源的溶菌酶（L6876，41850 U/mg蛋白质）、猪胰腺来源的α-淀粉酶（A3176，12 U/mg固体）以及牛胆汁均购自Sigma-Aldrich公司（美国密苏里州圣路易斯）。O-苯二醛（OPA）亦由该公司提供。

肽含量与生物利用度

使用WSF 3 kDa色谱仪分析了FM-572和未发酵牛奶在SGD前后以及离体实验后的肽谱和肽含量（图1）。总体而言，FM-572的肽含量在SGD前后显著高于未发酵牛奶（p < 0.05）。SGD后，肽含量显著增加，表现为峰强度更高、峰数更多。值得注意的是，SGD后肽的含量...

结论

本研究表明，使用Lactococcus lactis NRRL B-50572发酵牛奶可产生具有HMGCR抑制活性的生物可利用肽，这一点通过模拟胃肠道消化后的肠道吸收得到了验证。尽管吸收后的总肽含量与未发酵牛奶无差异，但发酵牛奶的抑制活性更强，这突显了肽组成和抑制能力的重要性。

作者贡献声明

Miguel A. Rendón-Rosales： 资料撰写、方法设计、概念构建。 María J. Torres-Llanez： 资料撰写、审稿与编辑、验证、软件操作。 Joel S. García-Romo： 资料撰写、审稿与编辑、软件操作。 Lilia M. Beltrán-Barrientos： 资料撰写、审稿与编辑、数据分析。 Miguel A. Mazorra-Manzano： 数据分析。 Adrián Hernández-Mendoza： 资料撰写、审稿与编辑、数据分析。 Aarón F. González-Córdova： 资金筹措、数据分析。 Belinda：

伦理声明

所有实验程序均获得了食品与开发研究中心（墨西哥索诺拉州埃莫西略市）生物伦理委员会的批准（CE/017/2019），并遵循了国家研究委员会关于实验动物护理和使用的指导原则。

资金来源

本研究得到了墨西哥首都科学技术创新部（SECIHTI）的研究项目CF-2023-G-1129 CONAHCYT的支持。

未引用参考文献

Boachie, Yao and Udenigwe, 2018 Ishimwe, Daliri, Lee, Fang and Du, 2015 Pak, Koo, Kwon and Yun, 2012 Pak, Kwon, Khojimatov, Pak and Sagdullaev, 2021

利益冲突声明

作者声明不存在可能影响本文研究的已知财务利益或个人关系。

致谢

作者感谢墨西哥科学技术创新部（SECIHTI）通过项目CF-2023-G-1129提供的资助。同时，作者也非常感谢SECIHTI为Miguel á. Rendón-Rosales、Lilia M. Beltrán-Barrientos和Joel S. García-Romo提供的博士后奖学金。此外，还要特别感谢伊比利亚-美洲科技发展计划（CYTED）和促进...