1,2,4-三氯苯（1,2,4-TCB）对Folsomia Candida的生态毒性：来自多层次实验和分子模拟的见解

《Journal of Environmental Sciences》：Ecotoxicity of Folsomia Candida induced by 1,2,4-TCB: Insights from multi-level experiments and molecular simulations

氯苯污染对土壤跳虫的毒性机制及生态风险评估研究。通过生物标志物（乙酰胆碱酯酶、抗氧化酶）、分子对接和转录组学分析，发现1,2,4-三氯苯在亚致死浓度下诱导氧化损伤、神经功能异常及繁殖抑制，影响细胞色素P450和肽酶活性通路。

　　

杜荣华|冯吉贤|牛雪|林向龙|郭飞|吴凤昌

江南大学环境与生态学院环境过程与污染控制研究所，中国江苏省无锡市214122

摘要

工业化学品和农药的大规模生产和应用加剧了土壤中氯苯类物质的污染，尤其是1,2,4-三氯苯（1,2,4-TCB），这对土壤生物的安全构成了严重威胁。然而，1,2,4-TCB对土壤生物的毒性影响仍不明确。本研究通过整合多种生物标志物、转录组分析和分子对接技术，探讨了1,2,4-TCB对土壤无脊椎动物——尤其是弹尾虫Folsomia Candida的影响。结果表明，暴露7天后，乙酰胆碱酯酶（AChE）和抗氧化酶活性的动态变化表明，不同浓度的1,2,4-TCB可能导致弹尾虫出现氧化损伤和神经功能异常，这些结果通过分子对接模拟得到了进一步验证。转录组分析显示，几丁质结合酶、（内）肽酶活性和丝氨酸（内）肽酶活性在处理组中均受到抑制。高剂量处理（97.16 mg/kg）显著激活了与神经毒性和多种疾病共病相关的通路。这些分子层面的变化伴随着弹尾虫死亡率的显著增加和繁殖能力的下降。总体而言，这些发现扩展了我们对1,2,4-TCB对土壤无脊椎动物毒性的机制理解，并为氯苯污染物的环境风险评估提供了重要信息。

引言

1,2,4-三氯苯（1,2,4-TCB）是一种重要的有机氯化合物，广泛应用于工业和农业生产中。农药、纺织品、药品、皮革、电子制品等工业原料、中间体和溶剂的生产过程中，导致了1,2,4-TCB向环境的排放（Shang等，2020；Zhang和Wu，2017）。1,2,4-TCB的大规模使用和持久性使其在土壤、废水、沉积物和植被中积累，人类可能通过皮肤接触、吸入空气、饮用水和食物摄入而暴露于该物质（Cai等，2002；Ding等，2014；Niu等，2023）。作为农药的主要生产和使用国，中国报告了严重的氯苯污染问题，长江三角洲地区废弃农药厂周围的土壤中1,2,4-TCB浓度高达2.93 mg/kg（Cai等，2002）。美国环境保护署和联合国环境规划署已将1,2,4-TCB列为优先污染物（Diaz等，2006），对生态安全和人类健康构成严重威胁（Chen和Liu，2015；Zhang和Wu，2017）。研究表明，1,2,4-TCB暴露会影响哺乳动物的肝脏、肾脏、肾上腺和生殖系统（Valkusz等，2011）。

土壤无脊椎动物，如蚯蚓、弹尾虫和线虫，是陆地生态系统不可或缺的组成部分，在维持土壤健康和促进养分循环中起着关键作用。这些生物的不同营养级已被广泛用作土壤污染的生物指标，为全面的生态风险评估提供了坚实的基础。然而，尽管土壤中的氯苯污染严重，但其生态毒性评估仍然相对较少。迄今为止进行的生态毒性研究中，主要关注个体水平的终点（如存活率和繁殖能力）和细胞水平的生物标志物（如抗氧化酶和解毒酶活性）。外源性污染物压力可以触发生物体的自我保护机制，通常表现为酶活性异常、代谢途径变化和行为调整（Liu等，2018；Wang等，2021a）。过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽S-转移酶（GST）、乙酰胆碱酯酶（AChE）、脂质过氧化物酶（LP0）和细胞色素P450酶（CYP450）是参与生物体解毒机制的敏感靶标，可用作检测弹尾虫生态毒性的指标（Skulcová等，2020）。尽管如此，阐明表型效应与生物标志物响应中的分子扰动之间的机制联系对于完善弹尾虫检测在1,2,4-TCB暴露生态风险评估中的应用仍然至关重要。近年来，转录组技术通过揭示基因表达水平和途径的变化，提供了对污染物毒性的深入理解（Lin等，2024；Tang等，2020；Zheng等，2024b）。例如，在一项最新研究中，研究人员发现，在高砷（As）压力下，大多数与肽酶活性相关的差异表达基因（DEGs）下调，导致Folsomia Candida的摄食率和消化功能受到抑制，进而影响生长和繁殖（Lin等，2024）。

弹尾虫是一类典型的土壤无脊椎动物，在全球土壤生态系统中通过调节能量流动和养分循环发挥着不可或缺的作用（Fountain和Hopkin，2005）。F. candida因其孤雌生殖、简短的生命周期和对环境压力因素的敏感性而成为理想的生态毒性模型生物（Ju等，2019；Lin等，2019；Zheng等，2024a）。本研究旨在利用与存活率和繁殖能力相关的生物标志物（如抗氧化酶和解毒酶）以及分子对接技术，阐明1,2,4-TCB暴露对F. candida发育、生理和其他表型结果的影响。这些研究的目的是阐明F. candida在亚致死浓度1,2,4-TCB压力下的基因表达和途径活性变化，从而加深我们对F. candida对氯苯压力反应机制的理解，尤其是在未观察到显著表型终点的情况下。此外，这些发现将有助于探索土壤氯苯污染的生态风险评估。

实验部分

慢性毒性测试

1,2,4-三氯苯（CAS编号：120-82-1，C₆H₃C₁₃，纯度>99%）购自Alfa Aesar（Johnson Matthey公司），使用丙酮（HPLC级，Sigma-Aldrich）作为溶剂进行稀释。测试土壤（表层土壤：0-10厘米）采集自中国江苏省宜兴市。去除草根后，土壤在室温下风干、研磨并过筛（2毫米）以供进一步使用。测试结果显示该土壤未受到1,2,4-TCB污染

1,2,4-TCB暴露对F. candida存活率和繁殖能力的影响

暴露于1,2,4-TCB处理过的土壤28天后，浓度低于80 mg/kg的土壤中F. candida成虫的存活率与对照组无显著差异（P > 0.05）。在更高剂量的1,2,4-TCB（120-350 mg/kg）下，F. candida成虫的存活率开始显著下降（P < 0.05）（图1a）。同样，在较高1,2,4-TCB暴露水平下，幼虫数量也显著减少，分别减少了59.81%（120 mg/kg）和81.87%（240 mg/kg）

1,2,4-TCB暴露对F. candida存活率和繁殖能力的影响

在本研究的初步实验中，我们观察到F. candida的存活率和繁殖率与1,2,4-TCB暴露水平呈负相关。当1,2,4-TCB暴露剂量达到120 mg/kg时，成虫的存活率开始显著下降（P < 0.05）。幼虫对1,2,4-TCB的敏感性更高，在40 mg/kg剂量下存活率显著下降（P < 0.001），相比20 mg/kg剂量减少了13.5%

结论

本研究通过生物标志物活性、分子对接实验和转录组学，评估了1,2,4-TCB在两种亚致死浓度下对F. candida的毒性，重点关注其对生长、繁殖、氧化损伤、细胞凋亡和神经毒性的影响。结果表明，CAT、GST、AChE和LPO在缓解1,2,4-TCB引起的氧化损伤中起作用。

作者贡献声明

杜荣华：撰写——初稿、软件开发、方法学设计、数据分析、概念构建。冯吉贤：数据可视化、验证、监督、软件使用、方法学设计、概念构建。牛雪：监督、软件使用、实验研究。林向龙：方法学设计、实验研究、数据分析。郭飞：验证、监督、资源获取、方法学设计、实验研究、资金筹集。吴凤昌：数据可视化、验证、监督、数据分析

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

致谢

本研究得到了中国国家重点研发计划（编号：2023YFC3708700）的支持。我们感谢三位匿名审稿人和编辑提出的建设性意见。同时感谢中国环境科学研究院的Lin Changkun和Shan Li在实验中的协助。