通过细胞表面展示技术实现低温适应性芳基酯酶的特性及高效降解低温度聚丁酸丁二醇酯（PBAT）

《Journal of Hazardous Materials》：Characteristics of cold-adapted arylesterase and low-temperature efficient PBAT degradation via cell surface display technology

冷适应芳酯酶CsAE通过表面展示技术构建工程菌株BL21/pET-INPN-CsAE，在15℃下实现PBAT薄膜降解率20.46%，并验证其低温稳定性与重复利用性，为寒区PBAT污染治理提供新策略。

　　

王全福|李星顺|王亚通|侯彦华

哈尔滨工业大学海洋科学与技术学院，威海264209，中国

摘要

聚（丁酸-对苯二甲酸酯）（PBAT）在环境中的持续积累对生态系统构成了严重威胁。虽然酶促降解具有一定的潜力，但大多数已报道的酶需要较高的反应温度。此外，游离酶通常存在稳定性差和生产成本高的问题。本研究鉴定并表征了一种具有耐寒性的芳基酯酶（CsAE）。CsAE在20℃时表现出最佳活性，并且在0℃时仍保留了48.77%的残余活性，显示出耐寒酶的特性。通过INPN表面展示技术构建的工程菌BL21/pET-INPN-CsAE在保持外膜完整性的同时表现出正常的生长能力。与游离CsAE相比，这种全细胞催化剂具有显著提高的热稳定性、可重复使用性和长期操作稳定性。值得注意的是，PBAT薄膜上观察到的变化——包括孔隙和裂纹的出现、接触角减小、酯键断裂、非晶相减少以及降解产物对苯二甲酸的出现——共同表明CsAE和工程菌株均促进了PBAT的降解。生物修复实验证实，该工程菌株在15℃下21天内使PBAT降解了20.46%，证明了其在低温条件下的有效性。总体而言，这项工作确立了INPN介导的耐寒CsAE表面展示作为一种在寒冷环境中修复PBAT的可持续生物催化策略。

引言

石化塑料的广泛使用产生了持续的废弃物流，给生态环境带来了巨大负担[1]。其中，海洋塑料污染因其对人类健康的严重危害而受到越来越多的关注[2],[3]。为了解决这一问题，研究重点逐渐转向使用可生物降解的生物基塑料来替代传统塑料。PBAT具有优异的延展性和热机械性能与生物降解性之间的最佳平衡[4],[5],[6]。这些特性使其在农业薄膜及相关行业中得到广泛应用[7],[8]，使其成为使用最广泛的生物降解塑料之一[9]。尽管PBAT相对于传统塑料具有更好的环境生物降解性，但在自然环境中的降解速率仍然相对较低[10]。在自然土壤中埋藏478天后，PBAT的残留含量为每公斤土壤79±25毫克，降解效率为77%[11]。此外，可生物降解塑料容易分解成微塑料[12]，而PBAT衍生的颗粒在海洋环境中具有更强的持久性[13]。更令人担忧的是，PBAT可能对海洋生物产生不利影响[14]。因此，开发高效的酶/微生物降解系统对于解决海洋环境中的PBAT污染至关重要。

在环境中，PBAT塑料主要通过微生物及其胞外酶进行分解和矿化。研究表明，包括Alternaria alternata[15]和Thermobifida fusca[16]在内的微生物具有降解PBAT的能力。这些微生物产生多种聚酯水解酶，如羧基酯酶[17]、脂肪酶[18]和角质酶[15]，它们以不同的水解特异性作用于PBAT的酯键。例如，PBATHBp对B-T酯键的切割效率明显低于其对PBAT共聚物中B-A键的活性[19]；PpEst具有芳基酯酶活性，可将PBAT降解为对苯二甲酸（TA）和中间产物4-(4-羟基丁氧基羰基)苯甲酸（BuTA）[20]。由于不同生物体之间的密码子使用偏好存在差异，这可能对异源蛋白表达产生显著影响[21]，因此从系统发育上更接近的来源选择酶进行大肠杆菌（E. coli）中的异源表达可能会提高表达水平。此外，PBAT降解产生的所有碳原子都可以被微生物利用并转化为二氧化碳[22]。芳基酯酶（EC 3.1.1.2）作为羧酸酯水解酶，对芳香酯具有明显的底物选择性，因此在降解PBAT的酯键方面具有巨大潜力。然而，目前从细菌中分离出的大多数芳基酯酶的最适温度相对较高，这限制了它们在海洋和高纬度地区等寒冷环境中的降解性能[26],[27],[28],[29]。因此，迫切需要寻找和表征具有独特生物催化特性和降解功能的新型耐寒芳基酯酶，为在低温环境中高效去除PBAT的生物修复策略奠定基础。

在实际应用中，游离酶存在稳定性低、可重复使用性差和生产成本高的问题，这阻碍了它们在环境修复中的应用[30]。因此，迫切需要开发创新的表达工程策略，以建立能够在低温下降解PBAT的耐寒芳基酯酶的胞外生产平台。E. coli表面展示系统通过基因融合将目标蛋白稳定地展示在细胞表面，是生物技术和生物医学领域的一个通用且强大的工具[31]。这种依赖载体的方法在展示过程中保持了酶的功能[32]。与S层或LPP-OmpA蛋白等传统载体不同，冰核蛋白（INP）作为一种优选的酶展示平台，能够更好地满足目标酶的尺寸和空间要求[33]。冰核蛋白（INP-N）的N端富含疏水性残基和糖基磷脂酰肌醇（GPI），这种组成确保了INP-N在保持最佳外膜稳定性的同时促进融合蛋白的表达[34]。此外，通过细胞表面展示技术工程化的整个细胞催化剂使酶促反应直接在细胞表面进行，显著提高了反应速率[35]。通过离心收集工程菌株消除了繁琐的纯化步骤，从而提高了大规模生产的成本效益[33]。值得注意的是，表面展示系统在保持酶功能性和活性的同时，还增强了稳定性和可重复使用性[36]。因此，将INPN介导的E. coli表面展示与耐寒芳基酯酶结合使用，有望克服游离酶在实际生物降解应用中的固有局限性。同时，工程化的E. coli表面展示系统有望在低温条件下实现PBAT的降解，为在寒冷环境中绿色高效地修复PBAT污染物提供新的策略。

在本研究中，从南极海冰嗜冷菌Colwellia sp. ANT 801中分离出一种新型CsAE，对其进行了异源表达、表征，并分析了其耐寒结构特征和催化性能。使用细胞表面展示技术构建了工程菌株BL21/pET-INPN-CsAE，并全面评估了其在低温条件下的催化性能和适用性。通过场发射扫描电子显微镜（FESEM）和水接触角测量等多种分析技术评估了PBAT薄膜的降解情况。通过液相色谱-质谱（LC-MS）鉴定降解产物，并通过监测PBAT的重量损失定量确定了降解效率。通过优先考虑环境兼容性和成本效益，本研究建立了一个新的生物催化平台，为寒冷条件下的PBAT修复提供了创新范例。

章节片段

菌株和材料

通过对268株南极细菌的分离，鉴定出了具有PBAT降解能力的嗜冷海冰菌株Colwellia sp. ANT801。对该菌株进行了全基因组测序，随后进行了开放阅读框预测和基于BLASTP的同源性分析。这种方法鉴定出一种潜在的耐寒芳基酯酶，命名为CsAE。随后将csae基因克隆并在E. coli BL21中通过pET-28a表达

CsAE的基因鉴定和生物信息学分析

开放阅读框分析确定csae基因的长度为639个碱基对（bp），其产物是一种含有212个氨基酸的蛋白质（GenBank登录号：PX394058），理论分子量为23.49千道尔顿（kDa）。此外，CsAE仅含有6个盐桥，而其来自Pseudomonas aeruginosa的同源中温酶含有16个盐桥（图S1）。盐桥数量的减少增强了CsAE的整体灵活性，使其在低温下更容易进行构象调节——这是关键

结论

本研究涉及从海冰嗜冷菌Colwellia sp. ANT 801中异源表达和表征CsAE，该菌株表现出明显的耐寒特性。基于细胞表面展示技术，工程菌株BL21/pET-INPN-CsAE在低温条件下表现出显著的催化活性、长期稳定性和可重复使用性。无论是游离CsAE还是工程菌株，都能够在低温下降解PBAT

环境影响

可生物降解塑料PBAT进入生物圈后会对生态环境产生严重的负面影响。由于其降解速率和条件的限制，PBAT可能导致微塑料污染，并可能干扰水生生物的自然生理和生化过程。目前，对于PBAT降解酶在低温条件下的特性和应用仍缺乏全面了解。

CRediT作者贡献声明

王亚通：写作——审稿与编辑、可视化、资源获取、调查、资金筹集。李星顺：写作——审稿与编辑、初稿撰写、验证、方法学、数据分析、概念化。侯彦华：写作——审稿与编辑、监督、软件使用、资源管理、项目管理、资金筹集。王全福：写作——审稿与编辑、监督、项目管理、资金筹集。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了中国国家自然科学基金（41876149）、山东省自然科学基金（ZR2025MS552和ZR2023QD126）以及教学改革研究项目（2025ZZZC06）的支持。